Сайт Направленный Спин Этикетировочное и ЭПР спектроскопических исследований пентамерной лигандами ионных каналов

Общая цель данного протокола — продемонстрировать очистку, сайт-специфическое спиновое мечение и реконституцию пенямерного лиганд-зависимого канала для исследований методом электронного парамагнитного резонанса. Изучение динамики мембранных белков в физиологически релевантной среде имеет решающее значение для полного понимания механизмов работы этого мембранного транспортного белка. В связи с этими потребностями, по моему мнению, метод сайт-специфического спинового мечения и ЭПР подходит идеально.

Главным преимуществом данного метода является то, что он не ограничен размером белка. Таким образом, сайт-направленное спиновое маркирование и ЭПР-спектроскопия будут предпочтительными методами, если необходимо изучить динамику крупных белков или белков, реконструированных в мембранах. Внесите единичные мутации по цистеину в ген GLIC с помощью сайт-направленного мутагенеза.

Подготовьте ночную культуру мутанта GLIC по цистеину, как описано в текстовом протоколе. Затем добавьте 100 миллилитров стерильного калий-фосфатного буфера в автоклавированную среду Terrific Broth. После этого добавьте стерильную глюкозу, канамицин и 10 миллилитров ночной культуры.

Инкубируйте при 37 °C в шейкере при 250 об/мин. Добавьте 50 мл глицерина и продолжайте встряхивание культуры до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигнет 1,0–1,2. После индукции клеток 200 мкМ IPTG снова установите скорость шейкера на 250 об/мин и продолжите инкубацию в течение примерно 16 часов при 18 °C.

Соберите клетки в центрифужных бутылях объемом один литр, центрифугируя при 8500 ×g при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15 минут. Слейте супернатант и взвесьте бутыль с клеточным осадком, как описано в текстовом протоколе. Ресуспендируйте бактериальный осадок в 150 миллилитрах ледяного буфера A на один литр культуры.

Гомогенизируйте клетки, пропустив их через гомогенизатор в холодном помещении при температуре 4 °C. Повторите этот процесс трижды, чтобы лизировать большую часть бактерий. Центрифугируйте клетки при 14 000 ×g в течение 15 минут.

Затем отберите супернатант с помощью пипетки и перенесите его в чистую центрифужную пробирку. После центрифугирования супернатанта при 168, 000 ×g в течение одного часа осторожно слейте супернатант, не затрагивая осадок мембран. Отберите осадок мембран из одного литра культуры и ресуспендируйте его в буфере A с добавлением 10% глицерина до конечного объема 50 мл.

Добавьте 0,5 г DDM к суспензии мембран и инкубируйте на нутаторе в течение двух часов при температуре 4 °C. После солюбилизации мембран удалите клеточный дебрис из лизата путем центрифугирования при 168 000 ×g в течение одного часа. Тем временем подготовьте амилозную смолу.

Перенесите три миллилитра смолы с помощью пипетки в пустую полипропиленовую хроматографическую колонку. Промойте смолу, пропустив через нее 10 объемов слоя воды три раза, а затем 10 объемов слоя буфера A, содержащего 0,5 мМ DDM. После центрифугирования осторожно удалите супернатант с помощью пипетки и перенесите его в чистую коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Для пакетного связывания добавьте предварительно уравновешенную амилозную смолу в коническую пробирку. Свяжите экстрагированный белок со смолой, перемешивая смесь на нутаторе в течение двух часов при температуре четырех градусов Цельсия. Затем пропустите всю суспензию через хроматографическую колонку и соберите фракцию проскока.

Разбавьте белок GLIC 10 миллилитрами буфера A, содержащего 40 миллимолярную мальтозу, а также 0,5 миллимолярный DDM и 0,5 миллимолярный TCEP. TCEP предотвращает окисление боковых цепей цистеина. Соберите весь элюат.

Сконцентрируйте элюированный белок с помощью центрифужного концентратора до достижения концентрации от 4 до 6 мг/мл. Добавьте протеазу HRV 3C и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C. Для проведения сайт-специфического спинового This-маркирования сначала добавьте десятикратный молярный избыток спиновой метки MTSL к образцу, подвергнутому протеолизу, чтобы молярное соотношение мономера GLIC к MTSL составило 1:10.

После одного часа инкубации добавьте дополнительный спиновый зонд в пятикратном молярном избытке и инкубируйте еще один час. Пропустите образец через колонку для быстрого жидкостного хроматографа белков (FPLC) с разделением по размеру, предварительно уравновешенную Буфером А и 0.5 mM DDM, чтобы отделить отщепленный MBP-тег и избыток свободного спинового зонда от пентамеров GLIC. Сконцентрируйте белковый раствор с помощью центрифужного концентратора до конечной концентрации примерно 8–10 mg/mL и поместите его на лед.

Образец готов к реконституции. Для приготовления липосом промойте чистую круглодонную колбу объемом 25 миллилитров пятью миллилитрами хлороформа и высушите колбу струей газообразного азота в вытяжном шкафу. Затем перенесите 10 миллиграммов азолектина в колбу и высушите липиды под непрерывным потоком газообразного азота.

После испарения хлороформа поместите колбу в вакуум на один час для обеспечения полного высушивания. Затем добавьте один миллилитр буфера для реконституции А к высушенному липиду и интенсивно перемешайте содержимое колбы на вортексе, чтобы перевести липидный осадок в состояние суспензии. Для приготовления малых одноламеллярных везикул подвергните липидную суспензию воздействию ультразвука в охлаждающем ультразвуковом бане-соникаторе до тех пор, пока раствор везикул не станет более или менее прозрачным и не исчезнут видимые комочки.

К этой смеси добавьте DDM до конечной концентрации 4 мМ и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Для реконституции белка добавьте очищенный белок к липидной смеси. После инкубации образца при температуре 4 °C в течение одного часа при осторожном вращении разбавьте образец Буфером А до объема 15 мл. Удалите остатки детергента из суспензии с помощью полистирольных бусин с гидрофобными порами, которые связывают детергент.

Добавьте 80 mg чистых микросфер и инкубируйте суспензию липосом в течение ночи на нутаторе при температуре 4 °C. На следующий день перенесите липосомы в ультрацентрифужную пробирку объемом 25 ml, используя колончатый фильтр для удаления микросфер, и доведите объем образца до 25 ml путем разбавления. После центрифугирования образцов при 168 000 ×g в течение двух часов слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в 100 µL буфера B. Для проведения ЭПР-спектроскопии в режиме непрерывного излучения сначала перенесите суспензию липосом в пробирку объемом 200 µL и осадите образцы с помощью центрифуги.

После удаления супернатанта образец готов к измерениям ЭПР. Удалите из образца липосом как можно больше буфера. Для проведения обмена буфера перенесите 20 microliters осадка липосом в микроцентрифужную пробирку с помощью пипетки.

Добавьте 180 µL буфера D и инкубируйте при 42 °C в течение пяти минут. Центрифугируйте образец, удалите супернатант с помощью пипетки и повторите этот процесс трижды для обеспечения полного обмена буфера. Газопроницаемые пластиковые капилляры подходят для измерения как формы спектральных линий, так и доступности растворителя.

Прикоснитесь капилляром к осадку протеолипосом, чтобы забрать образец внутрь, и загерметизируйте конец костной воском. Здесь представлена биохимическая характеристика спин-меченных мутантов GLIC на гель-фильтрационной хроматограмме спин-меченного GLIC после протеолитического отщепления MBP-метки. Пики соответствуют пентамеру GLIC и свободному MBP.

На электрофорезе в ПААГ с SDS показан нерасщепленный мономерный слитый белок GLIC-MBP перед гель-фильтрацией, а также фракции MBP и GLIC, полученные в результате гель-фильтрации. Был проведен анализ на основе FRET для мониторинга состояния агрегации GLIC, реконструированного в различных мембранных липидах. Измерения FRET проводились для образцов после ночной реконституции и после нескольких циклов замораживания-оттаивания образцов.

В конфигурации inside-out патч-клампа, вырезанном из реконструированных везикул из азолектина, GLIC активируется скачками pH с использованием быстрого обменивателя растворов. Наблюдается активация каналов примерно через 10 миллисекунд и десенсибилизация с постоянной времени от одной до трех секунд. В процессе активации каналов отмечаются структурные перестройки.

В данном случае спектры электронного парамагнитного резонанса в режиме непрерывного облучения для определенной позиции в M2-спирали, выстилающей пору, демонстрируют изменения амплитуды и формы линий в ответ на изменение pH. ЭПР-спектроскопия является непревзойденным структурным методом измерения конформационных изменений мембранных белков в их естественной среде, позволяя выявить молекулярные детали динамики белков, которые остаются скрытыми при получении структур высокого разрешения методами рентгеновской кристаллографии или криоэлектронной микроскопии. При работе с данным методом важно помнить, что мутации довольно часто приводят к низкой и недостаточной олигомерной стабильности белка.

Следовательно, может возникнуть необходимость в разработке стратегии для решения этих проблем. Сочетание данных этих ЭПР-исследований с функциональными измерениями позволит получить более полную картину для изучения взаимосвязи между структурой и функцией; будущие технологические достижения будут направлены на использование этого мощного подхода для изучения более сложных человеческих каналов в более совершенных липидных условиях.