Поколение незрелые, зрелые и толерогенную дендритных клеток с отличающимися метаболический фенотипов

Общая цель этого протокола заключается в получении толерогенных и зрелых дендритных клеток из моноцитов для экспериментов или разработки вакцин. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, предоставляя модель для изучения развития, созревания и антигенной презентации дендритных клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет генерировать большое количество дендритных клеток in vitro для экспериментов.

Обогащение моноцитов начинают путем смешивания 20 микролитров предварительно приготовленных мононуклеальных клеток периферической крови или суспензии клеток PBMC с 20 микролитрами трипанового синего, чтобы подсчитать количество живых клеток с помощью цитометра. Затем центрифугируйте клеточную суспензию. Полностью отасканируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу до концентрации 80 микролитров окрашивающего буфера на 10-седьмую клетки.

Добавьте 20 микролитров CD-4 микрогранул на 10 к седьмым клеткам. Хорошо перемешайте и инкубируйте клетки в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Промойте клетки одним миллилитром окрашивающего буфера на 10-7 клеток, и центрифугируйте клетки.

Полностью отасканируйте надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте клеточную гранулу. Получите среднюю колонку максимум на два умножить на 10 до восьмой общей ячейки и поместите колонку в магнитное поле сепаратора. Далее промойте колонку 500 микролитрами красящего буфера.

Пипеткой нанесите клеточную суспензию на колонку, а немеченые клетки, которые проходят через колонку, соберите в 15-миллилитровую пробирку. Замените новую 15-миллилитровую трубку под колонку и трижды промойте колонку 500 микролитрами буфера для окрашивания. Убедитесь, что резервуар колонки пуст, прежде чем добавлять новый буфер для окрашивания между промывками.

Снимите колонку с сепаратора, и поместите ее на свежую 15-миллилитровую трубку. Нанесите пипеткой один миллилитр буфера для окрашивания на колонку и немедленно промойте ячейки с магнитной меткой, сильно вдавливая поршень в колонку. Затем повторите этапы магнитной сепарации с использованием иллюстрированной фракции в новой колонке, чтобы повысить чистоту элементов CD14 plus.

Высейте четыре набора CD14 плюс моноциты в концентрации от нуля целых три целых до нуля целых пять десятых умножить на 10 до шестой на миллилитр среды для культивирования клеток IL-4 в шесть луночных планшетов. Инкубируйте клетки в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия с пятью процентами CO2. На четвертый день удалите из культуры 850 микролитров среды, и центрифугируйте.

Отсадите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды для культивирования клеток. Добавьте клеточную смесь обратно в культуру. На пятый день добавьте один микролитр витамина D3 и один микролитр дексаметазона на один литр среды к двум наборам, чтобы получить толерогенные moDC.

На шестой день добавьте 200 нанограмм на миллилитр GMCSF и 200 нанограмм на миллилитр IL-4 ко всем наборам. Добавьте один микрограмм на миллилитр ЛПС в один из наборов, обработанных только GMCSF и IL-4, чтобы получить зрелые moDC. Добавьте один микрограмм на миллилитр ЛПС к одному набору толерогенных моДХ, чтобы получить толерогенные моДК ЛПС.

Наконец, на седьмой день соберите различные типы MoDC, промыв чашку для культуры PVS EDTA. Незрелые моДК получали путем добавления GMCSF и IL-4 к очищенному CD-14 плюс моноцитам в нулевой, четвертый и шестой дни. Добавление витамина D3 и дексаметазона после GMCF и IL-4 приводило к дифференцировке незрелых moDC в толерогенные moDC.

ЛПС был добавлен для стимуляции созревания незрелых моDC до зрелых moDC. А толерогенные моДК стимулировали с помощью ЛПС для проверки устойчивости к созреванию. Анализ поверхностных маркеров DC показал, что зрелые moDC экспрессируют самые высокие уровни маркеров созревания HLA-DR, CD80, CD83 и CD86.

И наоборот, толерогенные moDC демонстрировали повышенную экспрессию CD14, BDCA3 и иммуноглобулиноподобных транскриптов по сравнению с незрелыми и зрелыми moDC. При использовании красных CMXRos для отражения митокондриальной активности, было обнаружено, что толерогенные moDC обладают более высокой митокондриальной активностью по сравнению с другими дифференцированными подтипами moDC. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области иммунологии к изучению метаболических особенностей в дендритных клетках для разработки вакцин и иммунотерапии.