Метил-связывающий захват Секвенирование ДНК для ТКАНЕЙ Patient

Общая цель этого метода заключается в систематическом исследовании полногеномного ландшафта метилирования ДНК в больших когортах пациентов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, особенно в отношении того, какие области в ландшафте метилирования ДНК нарушаются у пациентов. Основным преимуществом данной методики является то, что большое количество пациентов может быть обследовано экономически эффективным способом.

Эта технология может иметь положительное влияние на терапию и диагностику пациента, потому что мы можем исследовать существующие биомаркеры, а также выявлять новые биомаркеры. Хотя этот метод может дать представление о когорте пациентов, он также может быть применен к другим системам, таким как метилирование ДНК в клетках, полученных из культивируемых клеточных линий из образцов, полученных от мышей. Демонстрировать эту процедуру вместе с доктором Я-Тин Сюй будет г-н Джозеф Лю, техник нашей лаборатории.

Часть секвенирования будет продемонстрирована г-жой Дон Гарсия, которая является техником в нашем ядре секвенирования. После выделения геномной ДНК из опухоли или нормальной ткани в соответствии с текстовым протоколом, добавьте 1,2 микрограмма общей геномной ДНК к 96 микролитрам TE-буфера и 24 микролитрам 5X-связывающего промывочного буфера, чтобы получить раствор объемом 120 микролитров. Обрабатывайте раствор ДНК ультразвуком в течение 30 секунд, затем дайте ему отдохнуть в течение 30 секунд.

Повторите соневку в общей сложности от 20 до 25 раз. Используйте биоанализатор с коммерческим высокочувствительным набором ДНК в соответствии с протоколом производителя для запуска одного микролитра раствора ДНК для проверки размера фрагментов. Они должны быть в диапазоне от 150 до 350 пар оснований.

Чтобы провести элюирование одной фракции, приготовьте элюирующий буфер, сделав раствор один к одному из буфера с низким содержанием солей и буфера с высоким содержанием солей. Используйте 200 микролитров элюирующего буфера для ресуспендирования метилсвязывающей ДНК или шариков MBD и инкубируйте суспензию во вращающемся миксере в течение трех минут. После инкубации поместите пробирку на магнитный штатив на одну минуту, затем осторожно нанесите жидкость, не касаясь кончика пипетки на шарики, и переложите ее в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, не содержащую DNase.

Храните этот образец на льду. Повторите элюирование для второго образца и соберите его в ту же пробирку, что и первый. К каждой незахваченной фракции промывки и разбавления добавьте один микролитр гликогена, одну десятую объема трех моляров ацетата натрия, pH 5,2 и два объема образца 100% этанола.

Хорошо перемешав раствор, выдерживайте при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее двух часов. Затем центрифугируйте реакцию при 11, 363 g и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы, и добавьте 500 микролитров холодного 70%-ного этанола.

Снова поверните трубку, прежде чем повторить промывку этанолом. Высушите гранулу на воздухе в течение пяти минут. Затем используйте воду без ДНКазы или буфер для ресуспендирования.

Убедитесь, что общее количество ДНК превышает 20 нанограмм согласно текстовому протоколу. Затем поместите ДНК на лед или храните при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Для подготовки библиотеки секвенирования ДНК используйте полностью автоматизированную систему построения библиотеки и следуйте стандартному протоколу, предоставленному производителем.

Отбирайте фрагменты ДНК длиной от 200 до 400 пар оснований для подготовки библиотеки. После подготовки библиотеки секвенирования ДНК удалите реакцию и используйте флуориметрическую систему количественного определения для количественной оценки библиотеки секвенирования ДНК. Чтобы настроить реакцию амплификации ПЦР, в пробирку для ПЦР добавьте 15 микролитров библиотеки для секвенирования ДНК, 25 микролитров мастер-смеси для ПЦР, два микролитра смеси для ПЦР праймера и восемь микролитров воды.

Используйте программу, изложенную в текстовом протоколе, внося коррективы по мере необходимости на основе рекомендаций производителя ПЦР-смеси. Проведите достаточное количество циклов для производства от двух до 10 миллимоляров библиотечной ДНК. После очистки реакций ПЦР нанесите штрих-код на каждый образец и соберите четыре образца в одну полосу проточной ячейки.

Используйте стандартный протокол одиночного чтения на 50 пар оснований нашего секвенирования. Проводить биоинформатику по текстовому протоколу. Используя MBD cap для идентификации островов CpG в различных областях генома, которые дифференциально метилированы в опухоли по отношению к нормальной ткани, это исследование показало, что из общего числа островов CpG, расположенных в промоторах генов, 19,5% показали дифференциальное метилирование в опухолях по сравнению с нормальными.

Аналогичным образом, 55,2% исследованных внутригенных островов CpG показали дифференциальное метилирование. Внутригенные промоторы показали 28,1%, а для промоторов генов без островков CpG — 1,8% — дифференциальное метилирование. Эта тепловая карта четко отображает дифференциально метилированные области в 77 опухолях молочной железы, 10 нормальных тканях молочной железы и 38 клеточных линиях рака молочной железы.

На этом рисунке метилирование количественно определено в двух подгруппах рака эндометрия, нерецидивирующем и рецидивирующем, у двух пациенток с разными сайтами CpG в промоторном острове CpG идентифицированного гена-мишени SFRP1. После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре-пять дней, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что сначала нужно проверить качество тестируемой геномной ДНК. После этой процедуры могут быть выполнены дополнительные методы, такие как пиросеквенирование, чтобы ответить на такие вопросы, как, например, каковы точные CpG в идентифицированных дифференциально обогащенных областях, которые были изменены? После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области эпигенетики к изучению метилирования ДНК в больших когортах пациентов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как исследовать полногеномное метилирование ДНК в образцах пациентов с помощью метода секвенирования MBD cap. Имейте это в виду, иногда бывает трудно получить высокое качество ДНК из образцов FFP и ДНК, поэтому при выполнении процедуры всегда проводится надлежащая оценка геномной ДНК.