FRET визуализации в трехмерных гидрогелей

Общая цель данного экспериментального метода заключается в обеспечении возможности изучения внутриклеточной сигнализации в режиме реального времени с помощью FRET-визуализации клеток, встроенных в трехмерные гидрогели, которые имитируют естественные ткани. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области биологии развития, фармакологии и регенеративной медицины, таких как разработка оптимальных биоматериалов и высокопроизводительный скрининг лекарственных препаратов в искусственно созданных 3D-микротканях. Основным преимуществом данной методики является то, что FRET может быть применен к большому количеству клеток в различных типах гидрогелей с использованием стандартных систем широкопольной микроскопии.

После изготовления форм для отливки гидрогеля и суспендирования культивируемых клеток в растворе гидрогеля, в соответствии с текстовым протоколом, в ламинарном шкафу для культур тканей с использованием стерильной техники добавьте прекурсор, содержащий клетки, в формы для отливки. Перед сшиванием центрифугируйте клетки, суспендированные в прекурсоре гидрогеля, чтобы оптимизировать визуализацию путем локализации клеток в одной фокальной плоскости и минимизации сигнала вне плоскости. Затем, для сшивания гидрогелей PC, используйте источник УФ-излучения спектра UVA с временем экспозиции, равным 3.2 джоулям на квадратный сантиметр на миллиметр толщины, для облучения прекурсора, содержащего клетки.

В качестве альтернативы можно использовать менее дорогой ручной стоматологический светильник. Избегайте избыточного облучения гидрогеля, так как это снизит жизнеспособность клеток. Физически сшиваемые гидрогели вместо этого помещают при температуре 37 °C.

После сшивания удалите форму для литья ПДМС-гидрогеля и замените ее предварительно подготовленной чашкой из ПДМС. С помощью стерильного шпателя прижмите ПДМС к стеклу для обеспечения адгезии. Добавьте бесфеноловую среду без сыворотки или химически определенную среду в лунку, созданную в чашке из ПДМС с покровным стеклом, чтобы гидрогель оставался погруженным.

Инкубируйте чашку при 37 °C в течение 30 минут. После того как чашка из PDMS с гидрогелем будет закреплена на предметном столике микроскопа, а на объектив будет нанесено иммерсионное масло, используйте проходящий свет, чтобы найти не менее 15 клеток для визуализации, и подтвердите трансфекцию с помощью флуоресцентной микроскопии. В программном обеспечении микроскопа настройте параметры камеры для каналов получения FRET-изображений, выбрав несколько клеток вблизи центра поля зрения, и оптимизируйте время экспозиции и усиление для каждого канала изображения в соответствии с текстовым протоколом.

Выберите клетки, расположенные близко к центру гидрогеля, в пределах относительно равномерного поля освещения, которые не являются слишком яркими или слишком тусклыми и имеют коэффициент FRET от 0,0 до 1,0. Затем выберите несколько полей зрения для получения изображений как минимум 15 трансфицированных клеток. По завершении выключите свет, чтобы ограничить воздействие освещения.

Для настройки частоты захвата при получении изображений в режиме таймлапс введите периодичность захвата. Используйте высокую частоту для регистрации базового сигнала, например, каждые пять секунд на поле зрения, и более низкую частоту для последующего изучения кинетики сигналинга в долгосрочном периоде. Выберите Run now, чтобы начать получение изображений и осуществлять захват в течение пяти минут для установления базового уровня отклика зонда в выбранном поле зрения.

После пяти минут сбора изображений с помощью пипетки внесите необходимый агонист или антагонист, перемешайте путем пипетирования и продолжите визуализацию. Выполнив калибровку FRET согласно текстовому протоколу, в программном обеспечении микроскопа выберите стрелку на иконке фоновой области интереса и выберите «Draw Elliptical Background Region of Interest» (Нарисовать эллиптическую фоновую область интереса). Для определения уровня фона нарисуйте и обозначьте по одной области интереса, или ROI, на каждое поле зрения рядом с клетками.

Убедитесь, что выбран пункт Keep Updating Background Offset, затем активируйте просмотр фоновой области интереса, нажав на иконку Background Region of Interest. В качестве альтернативы выберите иконку области интереса и установите в свойствах области интереса параметры Use as Background Region of Interest и Regions of interest are different in each Multi Point. Используя иконку фоновой области интереса, выберите Subtract Background Using Region of Interest.

В появившемся окне в разделе Subtract Background Region of Interest выберите Every Image, а в разделе Apply To выберите All Frames. Чтобы для каждого поля зрения определить область интереса вокруг клетки, используя канал эмиссии акцептора и бинарную маску, воспользуйтесь меню Binary, Define Threshold и выберите Apply To Current Frame. Затем отрегулируйте нижний порог, чтобы выделить клетки.

Затем, при необходимости, используйте функцию Binary Close для заполнения отверстий в бинарной маске. После этого нажмите на значок Region of Interest и выберите Copy Binary to Region of Interest, чтобы сохранить бинарную маску в виде областей интереса. Добавляйте области интереса для последующих полей зрения к уже существующему пулу областей интереса.

Удалите все ошибочно выделенные области интереса. Затем нажмите правой кнопкой мыши на области интереса и убедитесь, что в их свойствах установлены параметры «Use as Standard Region of Interest» (использовать как стандартную область интереса) и «Regions of Interest are different in each Multi Point» (области интереса различаются для каждой многоточечной съемки). Области интереса клеток можно выделить вручную, однако следует проявлять осторожность, чтобы исключить ложные значения.

Данный протокол содержит процедуры для клеток, находящихся за пределами области равномерного освещения, а также для микроскопов, не имеющих плоского поля. Центрифугирование предшественников гидрогеля перед гелеобразованием позволило максимально увеличить количество клеток в одной фокальной плоскости рядом с покровным стеклом. Это минимизировало фоновый шум и повысило пропускную способность визуализации.

В данном эксперименте FRET для расчета соотношения FRET по методу гашения эмиссии (QE) для одноцепочечного бинарного зонда ICUE1 требовалось всего два изображения: QE, представляющее собой возбуждение и эмиссию CFP CFP, и эмиссию акцептора, представляющую собой возбуждение и эмиссию YFP YFP. Было выбрано несколько полей зрения, в которых несколько клеток находились в зоне однородного освещения, как показано здесь. Области интереса (ROI) для коррекции фонового сигнала каналов и для анализа клеток были определены с использованием пороговых изображений эмиссии акцептора, полученных в начале экспериментов.

Кроме того, как показано здесь, были отобраны клетки с достаточным уровнем экспрессии зонда. Рассчитывались значения QE и отношения сенсибилизированной эмиссии FRET для каждого пикселя, а также среднее значение отношения FRET на одну клетку. Была вычислена величина, обратная отношению SE, после чего оба отношения были нормализованы.

При стимуляции форсколином оба метода определения соотношений FRET, основанные на квантовом выходе (QE) и спектральной эмиссии (SE), обнаруживают повышение активности циклического АМФ в хондроцитах. Как в физически, так и в химически сшитых гелях наблюдалось увеличение соотношения FRET QE с течением времени, что указывает на усиление сигнального ответа циклического АМФ на добавление форсколина. Данную процедуру можно использовать с другими методами микроскопии, такими как FRAP, FLIM-FRET, а также измерения FRET и анизотропии, для получения ответов на такие вопросы, как различия в проницаемости и клеточной передаче сигналов между разными типами микротканей.

Поскольку процесс сшивания подавляется вблизи PDMS, важно помнить, что формы для фотополимеризующихся гидрогелей следует проектировать с диаметром, который немного превышает диаметр самих гидрогелей.