FRET визуализации в трехмерных гидрогелей

Общая цель этого экспериментального метода заключается в том, чтобы обеспечить возможность изучения внутриклеточной сигнализации в режиме реального времени с помощью FRET-визуализации клеток, встроенных в трехмерные гидрогели, которые имитируют естественные ткани. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, фармакологии и регенеративной медицины, такие как разработка оптимальных биоматериалов и высокопроизводительный скрининг лекарств в сконструированных 3D-микротканях. Основное преимущество этой методики заключается в том, что FRET можно использовать на большом количестве клеток в различных типах гидрогелей с помощью обычных широкопольных микроскопов.

После изготовления форм для литья в гидрогель и суспендирования культивируемых клеток в растворе гидрогеля, согласно текстовому протоколу, в колпак для культуры тканей добавить клетку, содержащую прекурсор, в формы для литья стерильной техникой. Перед сшивкой центрообразуйте клетки, взвешенные в гидрогелевом предшественнике, чтобы оптимизировать визуализацию путем ограничения клеток одной фокальной плоскостью и минимизации сигнала вне плоскости. Затем, чтобы сшить гидрогели из ПК, используйте источник света UVA в течение времени воздействия, равного 3,2 джоуля на квадратный сантиметр на миллиметр толщины, чтобы облучить клетку, содержащую предшественник.

В качестве альтернативы используйте менее дорогую ручную стоматологическую лампу. Избегайте чрезмерного воздействия гидрогеля, потому что это снизит жизнеспособность клеток. Физически сшивающие гидрогели вместо этого размещаются при температуре 37 градусов Цельсия.

После сшивания снимите форму для гидрогелевого литья PDMS и замените ее ранее подготовленной формой PDMS. С помощью стерильного шпателя прижмите PDMS к стеклу, чтобы приклеить его. Добавьте не содержащую фенола сыворотку среду или химически определенную среду в образовавшуюся в чашке PDMS с покровным стеклом, чтобы гидрогель оставался погруженным.

Выдерживайте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После того, как чашка PDMS с гидрогелем закреплена на предметном столике и на объектив было нанесено масло, используйте проходящий свет, чтобы найти не менее 15 клеток для визуализации, и проверьте трансфекцию с помощью флуоресцентной визуализации. В программном обеспечении микроскопа настройте параметры камеры для каналов изображения FRET, выбрав одну из нескольких ячеек вблизи центра поля зрения, и оптимизируйте экспозицию и усиление для каждого канала изображения в соответствии с текстовым протоколом.

Выбирайте ячейки, которые находятся близко к центру гидрогеля, в пределах относительно плоского поля освещения, которые не являются ни слишком яркими, ни слишком тусклыми, и с отношением FRET от 00 до 1,0. Затем выберите несколько полей зрения, чтобы получить изображения как минимум для 15 трансфицированных клеток. Выключите свет, когда закончите, чтобы ограничить экспозицию.

Чтобы настроить скорость захвата для получения изображений с интервальной съемкой, введите периодичность захвата. Используйте высокую скорость для захвата базового сигнала, например каждые пять секунд на поле зрения, и более медленную скорость для последующей долгосрочной кинетики сигнализации. Выберите Запустить сейчас, чтобы начать получение изображения и захватить изображения в течение пяти минут, чтобы установить базовые показатели для ответа зонда в указанном поле зрения.

По прошествии пяти минут получения изображения введите пипетку в нужный агонист или антагонист, перемешайте с помощью пипетирования и продолжайте визуализацию. После проведения калибровки FRET в соответствии с текстовым протоколом в программном обеспечении микроскопа выберите стрелку на иконке области интереса фона и выберите «Нарисовать область интереса на эллиптическом фоне». Нарисуйте и обозначьте одну область интереса (ROI) для каждого поля зрения рядом с ячейками, чтобы определить уровень фона.

Убедитесь, что выбран параметр «Продолжать обновлять смещение фона», затем активируйте просмотр интересующей области фона, щелкнув значок «Область интереса фона». Либо выберите значок области интереса и установите свойства области интереса как Использовать в качестве фоновой области интереса, а области интереса будут отличаться в каждой мультиточке. Используя значок фона области обзора, выберите Вычесть фон с помощью области обзора.

Во всплывающем окне в разделе «Вычесть область интереса фона» выберите «Каждое изображение», а в разделе «Применить к» выберите «Все кадры». Для определения области интереса вокруг ячейки с помощью канала излучения акцептора и двоичной маски для каждого поля зрения используйте меню «Двоичный», «Определить порог» и выберите «Применить к текущему кадру». Затем отрегулируйте нижний порог для выбора ячеек.

Затем используйте функцию Binary Close, чтобы заполнить пробелы в двоичной маске, если это необходимо. Затем с помощью значка «Область интереса» выберите «Копировать двоичный файл в область интереса», чтобы сохранить двоичную маску в качестве области интереса. Добавьте области интереса для последующих полей обзора к существующему пулу областей интереса.

Удалите все ложные области интереса. Затем щелкните правой кнопкой мыши по областям интереса и убедитесь, что их свойства «Использовать как стандартный регион интереса» и «Регионы интереса» различаются в каждой мультиточке. Область интересов клетки может быть нарисована вручную, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы удалить ложные значения.

Протокол содержит процедуры для клеток, которые находятся за пределами плоского поля освещения, и для микроскопов, которые не имеют плоского поля. Центрифугирование предшественников гидрогеля перед гелеобразованием позволило максимизировать количество клеток в одной фокальной плоскости вблизи покровного стекла. Это сводит к минимуму фоновый шум и повышает производительность изображения.

В этом эксперименте FRET, для расчета гашенного излучения, или QE, отношения FRET, требовалось всего два изображения для одноцепочечного двоичного зонда ICUE1, в том числе QE равно CFP CFP для возбуждения и излучения, а акцепторное излучение равно YFP YFP для возбуждения и излучения. Были выбраны множественные поля зрения, в которых несколько ячеек находились в пределах однородной области освещения, как показано здесь. С самого начала экспериментов были определены ROI для коррекции фона сигналов каналов и анализа клеток с использованием изображений акцепторного излучения с пороговым значением.

Кроме того, как показано здесь, были отобраны клетки, которые экспрессировали достаточное количество зонда. Были рассчитаны отношения QE и FRET сенсибилизированной эмиссии на пиксель, а также среднее отношение FRET на ячейку. Был рассчитан обратный коэффициент SE и оба коэффициента нормализованы.

При стимуляции форсколином отношения Fret на основе QE и SE обнаруживают повышенную циклическую активность АМФ в хондроцитах. Как физически сшитые, так и химически сшитые гели показали увеличение отношения QE FRET с течением времени, что указывает на повышенную циклическую сигнальную реакцию АМФ на добавление форсколина. Эта процедура может быть использована с другими методами микроскопии, такими как FRAP, flim fret и измерение ладов и анизотропии, чтобы ответить на такие вопросы, как, например, каковы различия в проницаемости и клеточном выделении между различными типами микротканей.

Поскольку сшивание закалывается рядом с PDMS, важно помнить о проектировании форм для фотосшивающих гидрогелей немного большего диаметра, чем сами гидрогели.