Фенотипирование режим для генетически модифицированных мышей используется для изучения генов, участвующих в человеческих болезней, связанных со старением

Общая цель этого режима тестирования состоит в том, чтобы создать серию простых тестов, которые могут быть использованы в качестве начального конвейера фенотипирования для направления последующих детальных исследований поведенческих фенотипов, структуры и функций тканей. Повторяются ли поведенческие и клеточные фенотипы заболеваний человека в мышиной модели. Основное преимущество этого метода заключается в том, что тесты могут быть проведены в лабораториях без предварительного опыта проведения таких экспериментов без значительных инвестиций, но при этом позволяют проводить дальнейшие детальные исследования.

Проводите тест задних конечностей ежедневно с четвертого по 10-й день после рождения, чтобы оценить силу, слабость и усталость проксимальных мышц задних конечностей. Для начала дайте мышам акклиматизироваться на тестовой площадке в течение 30 минут. Тем временем приготовьте новую коническую трубку объемом 500 миллилитров, промыв ее 70% этанолом, а затем засуньте один или два ватных шарика на дно трубки.

Закрепите эту трубку в вертикальном положении для проведения теста. Если вы не проходите тестирование, держите щенков рядом с матерью, чтобы поддерживать их температуру. После получасовой акклиматизации извлеките щенка из клетки и запишите его вес.

Затем осторожно подвесьте новорожденного за задние конечности над краем трубки так, чтобы щенок оказался лицом к вате. Затем подсчитайте количество попыток вытягивания, предпринятых щенком, и измерьте его задержку до падения. Подождав 30 секунд, повторите тест.

После второго теста пометьте щенка маркером. Затем аккуратно потрите щенка подстилкой из домашней клетки и верните его к матери. Потому что более взрослые щенки P8 не могут быть помечены, идентифицируйте их с помощью обрезки пальцев ног.

Прежде чем приступить к следующему щенку, протрите пробирку 70% этанолом. Проводите тест по наблюдению за отъемышем ежедневно с P19 по P21 для оценки уровня движения и общей активности. Начните с того, что дайте мышам акклиматизироваться в тестовой зоне в течение 30 минут.

Пока щенки акклиматизируются, подготавливают арену. Отметьте тестовую коробку из плексигласа сеткой размером шесть на шесть квадратных метров в два дюйма. Перед использованием коробку очистите ее 70% этанолом.

Затем расположите видеокамеру так, чтобы поле зрения заполнялось боковым видом всего блока. Стандартизируйте внешний вид окружения, чтобы избежать внесения новизны. Перед тестом переложите отлучение от груди в чистую чашку для удержания и запишите ее вес.

Затем началась видеосъемка. Сначала снимите тестовую идентификационную карту с идентификационным номером мыши, ее возрастом и текущей датой. Затем переложите мышку из держателя в центральный квадрат.

В течение трех минут посчитайте количество линий, пересеченных обеими передними лапами. Через три минуты верните мышь в чистую клетку и завершите запись видео. Между каждым тестом очищайте коробку с содержанием этанола 70%.

По видео посчитайте события вставания, когда мышь встает на дыбы, держа обе передние лапы без опоры. Также учитывайте события груминга, которые происходят, когда обе передние лапы заняты уборкой. Проводите тест на силу хвата через день между P22 и P26, чтобы оценить нервно-мышечную силу.

Как обычно, дайте мышам 30 минут на адаптацию к тестовой зоне. Испытательный аппарат представляет собой короб из плексигласа с сетчатой сеткой. Очистите оба этанолом на 70%.

Затем выстелите дно коробки слоем пузырчатой пленки для набивки и накройте пузырчатую пленку бумагой для впитывания выделений. Приступайте к разделению тестовых мышей и загружайте их в отдельные чашки. Теперь поместите первую мышь в центр проволочной сетки и медленно инвертируйте сетку на 10-20 сантиметров над мягкой поверхностью коробки.

Измерьте задержку до падения или завершите тест через 60 секунд, если мышь не упадет. Затем верните первую мышь в чашку для удержания. Между тестами протрите сетку 70% этанолом и заверните бумагу на пузырчатую пленку.

Затем проведите тест на двух других мышах в группе. После того, как каждая мышь будет протестирована один раз, повторите процесс еще дважды для трех испытаний на каждую мышь. Если в группе менее трех мышей, убедитесь, что время восстановления между испытаниями составляет не менее пяти минут.

Для окрашивания от диафоразы NADH смешайте равные объемы свежеприготовленного раствора NADH и свежеприготовленного раствора NBT. Затем добавьте по одному миллилитру раствора для окрашивания на каждое предметное стекло и выдержите предметные стекла во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Для окрашивания сукцинатгидрогеназой приготовьте раствор из 0,1 молярного сукцината натрия, 1,25 молярного NBT и 0,2 молярного фосфатного буфера.

Затем добавьте по одному миллилитру на каждую горку. Упакуйте предметные стекла во увлажненную камеру и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. После инкубации с любым из красителей отсадите раствор для окрашивания и трижды промойте предметные стекла дистиллированной водой.

Затем промойте горки через серию ацетоновых ванночек, концентрация которых увеличивается и уменьшается. С каждой концентрацией ацетона выполните три промывки по две минуты за одну промывку. Наконец, промойте слайды три раза в дистиллированной воде.

Затем смонтируйте предметные стекла с помощью водной среды. Мыши без экспрессии HTRA2 были обследованы с использованием описанной батареи тестов и сравнены с контрольной группой. Между P4 и P6 не было замечено никаких изменений в количестве вытягиваний или задержке падения. Между P7 и P10 было отмечено снижение нервно-мышечной силы.

В тесте активности наблюдалось снижение активности нокаутных мышей HTRA2. Мыши с нокаутом HTRA2 также показали снижение прочности в тесте на захват из проволочной сетки. Окрашивание H и E показывает, что у мышей с нокаутом HTRA2 не было видимых изменений в структуре сетчатки по сравнению с контрольной группой на уровне P35.

Наконец, для выявления изменений в функциях дыхательных ферментов было использовано гистохимическое окрашивание для определения активности комплекса электронных транспортных цепей. Наблюдалось снижение окрашивания у мышей с нокаутом HTRA2 по сравнению с контрольной группой. Это отмечалось в мозжечке и стриатуме, но не в коре.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оценивать активность и нервно-мышечную силу генетически модифицированных мышей, а также как сочетать эти исследования с клеточными осями. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.