Высокочувствительных и быстрое обнаружение флуоресценция с помощью портативного анализатора FRET

Общая цель данного протокола — продемонстрировать общую применимость FRET-анализатора при оптимальных условиях путем количественного определения содержания сахара в имеющихся в продаже напитках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сенсинга и мониторинга малых молекул, таких как сахар. Основным преимуществом данной методики является возможность эффективного мониторинга свежего сигнала, отвечающего на малые молекулы, без использования дорогостоящих высокотехнологичных флуориметров.

Процедуру продемонстрирует доктор Хан из нашей лаборатории. Сначала подготовьте плазмиду цианового и желтого флуоресцентного биосенсора, специфичного к мальтозе или сахарозе. Затем инокулируйте пять миллилитров бульона Луриа одной колонией E.Coli DE3 и инкубируйте культуру при 37 °C в шейкере в течение 16 часов.

Затем перенесите 1 мл культуры в колбу, содержащую 100 мл LB. Инкубируйте колбу при 37 °C в истряхивающем инкубаторе до достижения оптической плотности при 600 нм примерно 0,5. Центрифугируйте культуру в течение 20 минут при 4 °C. Быстро ресуспендируйте осадок в 50 мл ледяной дистиллированной воды и повторно центрифугируйте в течение 20 минут.

Ресуспендируйте осадок в 50 µL 10%-го (по объему) раствора глицерина в ледяной дистиллированной воде. Осторожно перемешивайте смесь до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигнет 100. В охлажденной кювете для электропорации смешайте полученную суспензию с 10 нг плазмиды CMY.

Проведите электропорацию смеси. Ресуспендируйте клетки в кювете в 1 mL среды SOC, затем перенесите их в круглодонную пробирку объемом 15 mL. Обеспечьте восстановление клеток, осторожно встряхивая пробирку при 37 °C в течение одного часа.

Рассейте клетки по чашке с LB-агаром, содержащим 100 µg/mL ампициллина. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 12 часов. С помощью петли перенесите одну колонию в 10 mL среды LB, содержащей 100 µg/mL ампициллина.

Инкубируйте смесь при 37 °C с перемешиванием в течение 12 часов для создания стартовой культуры. Перенесите 5 мл стартовой культуры в 500 мл среды LB с ампициллином и инкубируйте клетки при 37 °C в шейкере. Когда оптическая плотность при 600 нм достигнет 0,5, добавьте IPTG до конечной концентрации 0,5 мМ.

После инкубирования культуры в течение 24 часов центрифугируйте клетки в течение 20 минут. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в пяти миллилитрах связывающего буфера. Проведите соникацию клеток на льду в течение 10 секунд, а затем охлаждайте клетки в течение 10 секунд.

Повторите циклы соникации и охлаждения еще пять раз. Центрифугируйте лизат в течение 30 минут. Перенесите супернатант в другую пробирку.

Очистите супернатант на аффинной колонке с Ni-NTA. Залейте в концентрат с пределом отсечения 10 000 Дальтон 20 мл очищенного образца. Центрифугируйте образец в течение 10 минут, после чего долейте в концентрат 0,8% фосфатно-солевой буферный раствор.

Повторяйте этот процесс с остальной частью образца таким же образом, по 20 milliliters за раз, пока весь белок не будет концентрирован и обессолен. Храните очищенный FRET-биосенсор при 80 degrees Celsius. Приготовьте детектирующий раствор, состоящий из 0.2 micromolar раствора белка-биосенсора CMY и 0.8% PBS.

Включите портативный FRET-анализатор. Установите температуру анализа на 53 °C. Затем переведите прибор в режим калибровки.

Наполните кювету 0,8% PBS в качестве фона. Предварительно прогрейте образец в анализаторе до 53 °C, после чего установите значение фона. Затем наполните кювету детектирующим раствором.

Поместите кювету в анализатор и установите базовую линию. Замените кювету на кювету, содержащую детектирующий раствор и сахар в концентрации 1 мМ. Установите интенсивность при насыщении, чтобы завершить калибровку.

Для начала подготовки образца напитка к анализу содержания сахара центрифугируйте 1 мл напитка в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Удалите супернатант с помощью шприца объемом 1 мл и профильтруйте его через шприцевой фильтр с порами 0,2 мкм. Смешайте 0,1 мл фильтрата и 0,9 мл 0,8% PBS в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.

Осторожно перемешайте смесь на вортексе для полного разведения. Поместите 5 µL разведенного образца напитка и 495 µL детектирующего раствора в кювету. Поместите кювету в анализатор и предварительно нагрейте образец до 53 °C.

Нажмите кнопку set для измерения содержания сахара в образце. В данном методе эффективность FRET определяется по соотношению интенсивности эмиссии желтого флуоресцентного белка к циановому флуоресцентному белку в биосенсоре. Оптимальная температура измерения для этих биосенсоров CMY составляет от 50 до 55 °C, так как при таких условиях разница в соотношении интенсивности эмиссии между контрольным раствором и насыщенным раствором мальтозы максимальна.

Биосенсор CMY-BII был использован для определения содержания мальтозы в трех напитках при температуре 53 °C. Кривая зависимости «доза-ответ» строится путем получения этого соотношения при различных концентрациях мальтозы при заданной температуре. Соотношение эмиссии соотносится с концентрацией мальтозы с использованием значений, полученных в ходе калибровки.

Измеренное содержание мальтозы представлено вместе с общим содержанием сахаров, указанным производителями напитков. Напиток A содержал такие источники мальтозы, как рис и ячмень. Соответственно, выявленное количество мальтозы составляет около половины общего заявленного содержания сахаров.

Напиток C, спортивный напиток, имел очень низкое содержание мальтозы. При выполнении данной процедуры важно помнить, что работа с прибором и FRET-сенсорами должна осуществляться при температуре от 50 до 55 °C. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить количественный анализ таких малых молекул с помощью специально разработанного ручного FRET-анализатора.