Обнаружение Cortex Фрагменты Во время бактериальный прорастание спор

Общая цель этого пошагового протокола состоит в том, чтобы количественно оценить обилие фрагментов коры головного мозга или восстанавливающихся сахаров во время прорастания бактериальных спор. В этом методе будут подробно описаны шаги, необходимые для обнаружения наличия фрагментов коры или редуцирующих сахаров во время прорастания спор. Основным преимуществом этой методики является то, что большинство лабораторий располагают реактивами и оборудованием, необходимыми для успешного выполнения протокола.

Начните эту процедуру, поместив пробирку со спорами Clostridium difficile в нагревательный блок и инкубируя ее при температуре 65 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации поместите трубку на лед. Раствор для проращивания специфичен для изучаемых видов бактериальных спор.

Для определения проращивания спор C.difficile мы используем раствор 10 миллимолярного триса при pH 7,5 со 150 миллимолярами натрия хлорида, 100 миллимолярами глицина и 10 миллимолярами таурохолевой кислоты в деионизированной воде. Приготовьте один миллилитр раствора для проращивания на один образец плюс еще один миллилитр. Перед началом анализа переложите один миллилитр раствора для проращивания в микроцентрифужную пробирку и отложите в сторону.

Это послужит заготовкой для обнаружения фрагментов коры головного мозга. Далее в раствор для проращивания добавьте споры до OD600 примерно 3,0 и кратковременно сделайте вихрь. Такое количество спор хорошо подходит для замедления высвобождения фрагментов коры головного мозга во время прорастания спор C.difficile.

Сразу после добавления спор извлеките образец объемом 1,2 миллилитра в новую микроцентрифужную пробирку и поместите ее в центрифугу. Затем центрифугируйте при комнатной температуре в течение одной минуты при 14 000 раз по Г. Это нулевая временная точка. После отжима перелейте один миллилитр надосадочной жидкости в свежую двухмиллилитровую пробирку с завинчивающейся крышкой и заморозьте ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Повторяйте процесс взятия аликвот, вращения вниз и замораживания через равные промежутки времени до тех пор, пока образец не будет собран для каждого временного момента. Из-за времени, необходимого для центрифугирования и отбора проб, во время этой процедуры невозможно установить временные точки менее двух минут, поэтому эти пробы отбираются один раз в две минуты в течение 14 минут. Во время подготовки образцов коры головного мозга, если необходимо контролировать содержание дипиколиновой кислоты, удалите отдельный образец объемом 100 микролитров и распределите в микроцентрифужной пробирке на лед.

Также готовят образцы для построения стандартной кривой со следующими значениями N-ацетилглюкозамина. Ноль, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 и 5 000 наномолей в растворе для проращивания. После того, как образец был собран для каждого временного момента, достаньте образцы из морозильной камеры и лиофилизируйте их вместе с пустыми и стандартными образцами кривой.

Затем храните все образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования. В день проведения анализа повторно суспендируют лиофилизированные образцы, включая контрольные образцы и образцы стандартной кривой, в 120 мкл соляной кислоты с фенолом и бета-меркаптоэтанолом. Далее переложите все ресуспендированные образцы в свежие двухмиллилитровые пробирки с завинчивающейся крышкой.

Затем инкубируйте их на рециркуляционной водяной бане при температуре 95 градусов Цельсия в течение четырех часов. После инкубации поместите образцы на лед, пока они не остынут. Затем добавьте 120 микролитров гидроксида натрия трех моляров для их нейтрализации.

Далее добавьте в каждый образец 80 микролитров насыщенного раствора бикарбоната натрия и 80 микролитров 5%-ного раствора уксусного ангидрида и сделайте его вихревым способом. Затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации перенесите образцы обратно на водяную баню с температурой 95 градусов Цельсия ровно на три минуты.

Обратите внимание, что этот шаг чувствителен ко времени и более длительное время может повлиять на развитие нисходящего сигнала. Снимите образцы с водяной бани и охладите их на льду. Добавьте 400 микролитров тетрагидрата калия 6,54% тетрабората калия в каждую пробирку и вихрь.

Инкубируйте образцы на водяной бане с рециркуляцией при температуре 95 градусов Цельсия ровно на семь минут. Этот шаг также чувствителен ко времени. Извлеките образцы и положите их на лед на пять минут.

Пока образцы находятся на льду, приготовьте цветной реактив. Растворите 0,320 грамма ДМАБ в 1,9 миллилитрах ледяной уксусной кислоты. Обратите внимание, что этот реагент чувствителен ко времени, температуре и свету и не должен производиться заранее.

После того как DMAB полностью растворится, добавьте 100 микролитров 10 обычной соляной кислоты и перебейте образец в вихрь. Затем добавьте пять миллилитров ледяной уксусной кислоты и снова вортекс. Для колориметрической реакции перенесите 100 микролитров каждой охлажденной коры или контрольного образца в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Добавьте в каждый образец по 700 микролитров свежеприготовленного цветного раствора. Немедленно перенесите образцы на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия и инкубируйте образцы ровно 20 минут. После инкубации переложите по 200 микролитров каждого образца в прозрачную 96-луночную пластину.

Образцы должны быть желтого цвета, но они изменят свой цвет на фиолетовый, если присутствует восстанавливающийся сахар, который указывает на наличие коры головного мозга. Здесь многие образцы не показывают видимого фиолетового цвета. Тем не менее, образцы размером 250, 500 и 5000 наномолей визуально отличаются от отрицательного контроля с нулевым наномолем.

С помощью считывателя пластин определите поглощение на 585 нанометрах. При измерении в наружном диаметре 585 нанометров сигнал, генерируемый стандартными образцами, лучше всего подходит для линейной регрессии. В этой таблице приведены типичные результаты при использовании стандартов N-ацетилглюкозамина.

Затем эти данные были использованы для создания стандартной кривой, показанной здесь. Анализ проращивания проводили в условиях, способствующих проращиванию, с использованием буфера для прорастания с добавлением 100 миллимолярного глицина и 10 миллимолярной таурохолевой кислоты. В непрорастающих условиях только 100 миллимолярный глицин.

В отсутствие таурохолевой кислоты споры C.Difficile не прорастают, и присутствие фрагментов коры в растворе практически не меняется. Однако в присутствии как тауроколевой кислоты, так и глицина, споры C.difficile прорастают и выделяют фрагменты коры в раствор. Это абсорбируется в виде увеличения OD585 с течением времени в прореагировавших образцах.

Количество фрагментов коры головного мозга, высвобождаемых во время этого анализа, рассчитывали с помощью стандартной кривой. Как видно из этого анализа, большая часть коры была гидролизована или высвобождена через 15 минут после воздействия зародыша. Это говорит о том, что большая часть спор проросла именно в этот промежуток времени.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как обнаружить фрагменты коры или редуцирующие сахара в растворе для проращивания во время прорастания бактериальных спор. При попытке выполнить эту процедуру важно обратить пристальное внимание на время реакции, чтобы анализ развивался правильно.