Имплантация и запись Wireless электроретинограмму и вызванный потенциал зрительного нерва в сознании крысам

Общая цель этой процедуры заключается в измерении сознательных сигналов ERG и VEP после хирургической имплантации беспроводных телеметрических зондов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейронауки, например, как ведут себя нейроны без ограничений общей анестезии как в здоровых, так и в болезненных условиях. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет одновременно регистрировать электрофизиологию сетчатки и зрительной коры у животного, находящегося в сознании.

Для начала этой процедуры подготавливают электроды под микроскопом. Для этого раскрутите двухмногочечный электрод из нержавеющей стали с двумя плоскогубцами с тонким наконечником. Обрежьте одну из нитей из нержавеющей стали примерно на расстоянии одного сантиметра от кончика, оставив одну более длинную прямую прядь для формирования кольцевого электрода.

Затем сложите одну прядь из нержавеющей стали обратно в себя и скрутите, чтобы образовалось гладкое кольцо на кончике электрода. Затем сформируйте активный электрод ERG, скрутив основание петли так, чтобы получился круг диаметром от двух до пяти миллиметров. Для двух неактивных электродов ERG и одного неактивного электрода VEP сделайте диаметр петли точкой восемь миллиметров.

В этом примере подготовьте одну активную ЭРГ и три неактивных электрода. После этого зацепите круглый активный электрод VEP вокруг винта из нержавеющей стали так, чтобы электрод упирался в головку винта. Затем зацепите три неактивных электрода вокруг второго винта из нержавеющей стали.

Заземляющий электрод будет входить непосредственно в брюшную полость и нет необходимости делать петлю на конце. После бритья и дезинфекции места операции животного, находящегося под наркозом, хирургическим скальпелем сделайте 10-миллиметровый разрез на голове по средней линии между ушами. Затем сделайте пятимиллиметровый разрез на животе через слой кожи, по средней линии ниже грудины.

После этого туннель подкожно проведите канюлю диаметром пять миллиметров, от разреза живота до разреза головки. Подайте электродные провода тансмиттера через канюлю от живота к голове. Оставьте электрод сравнения с основанием передатчика.

Затем накройте все кончики электродов асептической марлей. Далее закрепите голову крысы на стереотаксической платформе. Хирургическими ножницами удлинейте разрез на лбу до 30 миллиметров.

Затем обнажите операционную область, втянув кожу двумя нитями. Соскребите надкостницу, расположенную над черепом, чтобы обнажить брегму, лямбду и швы средней линии. В последующем просверлите два отверстия в черепе по активным и ЭРГ, неактивным стереотаксическим координатам ЭРГ, ВЭП.

Прикрепите активные и неактивные электроды винтами из нержавеющей стали к черепу на глубину около одного миллиметра. Чтобы имплантировать активные электроды ЭРГ, используйте шов, чтобы временно втянуть верхнее веко. Затем введите канюлю 16-21 калибра подкожно из-за глаза через верхний свод конъюнктивы ко лбу.

Впоследствии снимите направляющую иглу. Далее подайте активный электрод через пластиковый катетер ото лба к глазу. Затем извлеките пластиковый катетер.

Используйте временный шов, который продевается через петлю электрода, чтобы предотвратить втягивание электрода обратно в туннель. После этого сделайте точечный пятимиллиметровый разрез на верхней конъюнктиве в одном миллиметре за лимбом. Используйте тупое рассечение, чтобы обнажить нижележащую склеру.

Затем вживите шов сразу за лимбом на половину толщины склеры и будьте осторожны, чтобы не проколоть глазное яблоко. Впоследствии снимите временный шов с активного электрода ЭРГ. Закрепите активный электрод ERG на шовной нитью половинной толщины склеры, завязав три последовательных узла, и убедитесь, что кончик электрода расположен близко к лимбусу для хорошего соотношения сигнал/шум.

При необходимости оттяните лишний электродный провод назад, чтобы активный электрод не ударялся о роговицу. Затем закройте лоскут конъюнктивы с помощью одного-двух прерывистых швов, чтобы полностью закрыть электрод ЭРГ. После этого снимите отводящий век шов.

Повторите процедуру для контралатерального глаза. Теперь нанесите цианоакрилатный гель на череп, чтобы закрепить все винты из нержавеющей стали и электродные провода. Перед фиксацией убедитесь, что активные электроды ERG не натянуты туго, чтобы обеспечить движения глаз.

Далее закройте разрез с помощью прерывистых швов. Затем поверните грызуна, чтобы обнажить область живота. Хирургическими ножницами удлините дермальный разрез брюшной полости до 40 миллиметров по белой линии.

После этого сделайте 35-миллиметровый разрез через внутреннюю мышечную стенку, чтобы обнажить внутреннюю брюшную полость. С помощью двух швов прикрепите тело трансмиттера к внутренней брюшной стенке животного справа и избегайте контакта с печенью. Сложите заземляющий электрод, закрепив его в петле двумя швами, и поместите его, свободно плавающий, в брюшную полость вместе с другими электродными проводами.

Впоследствии закройте брюшину с помощью сплошного шва. Затем закройте разрез кожи с помощью прерывистых швов. Для записи темных адаптированных сигналов животные приспосабливаются к темноте в течение 12 часов, а все процедуры предварительно проводятся в темной комнате с помощью тусклого красного света.

В иллюстративных целях запись будет вестись при нормальных условиях освещения помещения. Перед записью нанесите на роговицу крысы местную анестезию и расширяющие капли. Затем направьте животное, находящееся в сознании, в специально изготовленный прозрачный ограничитель.

Поместите крысу перед миской Ганцфельда так, чтобы ее глаза были выровнены с отверстием миски. Включите внутренний передатчик, пропустив магнит в пределах пяти сантиметров от него. Убедитесь, что передатчик горит, проверив светодиодный индикатор состояния на базе приемника.

Закройте клетку Фарадея, в которой находится контактная площадка приемника, чтобы улучшить соотношение сигнал/шум. Затем соберите сигналы в диапазоне световых энергий. На этом рисунке показано, как формируется волна ЭРГ у крыс в сознании на седьмой день после операции.

Реакция ЭРГ регистрировалась в диапазоне энергии стимула, при этом реакция на тусклую вспышку была показана внизу, а самая яркая вспышка — вверху. На 28-й день после операции эти формы волн оставались такими же, как и на седьмой день. В течение четырех недель не наблюдалось существенного временного влияния на амплитуду и чувствительность фоторецептора.

Стержневая биполярная ячейка амплитуда и чувствительность. Амплитуда биполярных ячеек конуса. И неявное время.

Аналогичным образом, формы волны VEP, по-видимому, сопоставимы через 7 и 28 дней после операции. С амплитудными и временными параметрами, не показывающими существенного временного эффекта. Эти результаты показали надежную стабильность сигнала ERG и VEP.

После освоения хирургическая составляющая методики будет завершена за полтора-два часа. Компонент сознательной записи, если он правильно сформирован, может быть выполнен за 45 минут. После этой процедуры также могут быть использованы другие методы, такие как фармакологические манипуляции или манипуляции с болезнями.

Это позволит ответить на дополнительные вопросы в области разработки лекарств, а также хроники лонгитюдных экспериментов. Кроме того, при необходимости эта процедура может быть проведена и у других животных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить хирургическую имплантацию и последующее измерение сознательных телеметрических сигналов ERG и VEP.