Улучшенная техника швейцарско-прокатка для Кишечные Подготовка ткани для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализов

Общая цель этого метода заключается в эффективной обработке длинных участков кишечной ткани мыши для равномерного гистологического окрашивания по всей ее длине. Для получения отделов кишечника могут быть вариации окрашивания по всей длине кишечника. Я попробовал использовать стандартную технику швейцарского скручивания, но обнаружил, что она дает очень жесткую кишечную ткань, которую нелегко открыть.

После некоторых экспериментов я придумал метод быстрой фиксации, который использует меньше токсичных химикатов и позволяет гораздо лучше скручивать кишечную ткань. Модифицированный фиксатор можно использовать для быстрой фиксации других толстых тканей. В процессе подготовки усыпьте подопытное животное в соответствии с текстовым протоколом и подготовьте хирургическую установку.

Для начала с помощью рассекционных щипцов и ножниц сделайте боковой разрез в середине живота примерно на один-два сантиметра ниже грудной клетки, в зависимости от размера мыши. Затем аккуратно раздвиньте и срежьте кожу, чтобы обнажить мышцы живота. Далее возьмитесь и подтяните мышцы вверх, не удерживая и не тяня за кишки.

Затем аккуратно сделайте первоначальный разрез в мышцах живота и аккуратно разрежьте их, чтобы обнажить кишечник. Теперь определите толстую кишку и проследите ее до ее дистального конца, где она соединяется с прямой кишкой. Затем с помощью ножниц пересеките толстую кишку как можно ближе к анальному отверстию.

Далее найдите место, где желудок соединяется с тонким кишечником и с помощью ножниц разрежьте кишечник примерно в одном сантиметре от желудка. Теперь перенесите всю длину свободной тонкой кишки и толстой кишки в чистую чашку Петри, содержащую PBS. Затем закрепите дистальный конец толстой кишки и аккуратно распутайте всю длину толстой кишки, удаляя все прикрепленные брыжеечные ткани.

Затем определите слепую кишку и пересеките кишечник там, где слепая кишка соединяется с толстой кишкой, изолируя таким образом толстую кишку. Аналогичным образом распутайте остальную часть тонкой кишки от прикрепленных брыжеечных соединительных и жировых тканей. Затем пересеките тонкую кишку там, где она соединяется со слепой кишкой.

Затем слепая кишка может быть удалена и выброшена. Теперь наполните 10-миллилитровый шприц модифицированным фиксатором Буэна и прикрепите иглу для зондажа. Введите иглу примерно на полсантиметра в переднее отверстие кишечного сегмента.

Прочно закрепив иглу зондажа внутри сегмента, медленно промойте содержимое ткани фиксатором. Будьте осторожны, так как слишком большое давление приведет к разрыву сегмента. Если тонкая кишка кажется слишком длинной, вы можете сначала разрезать ее на три равных сегмента и промыть каждый сегмент отдельно.

Фиксация приведет к тому, что цвет кишечного сегмента станет непрозрачным. Далее с помощью ножниц разрежьте сегмент в продольном направлении по брыжеечной линии, а затем кратковременно промойте сегмент в чашке PBS, держа его открытым щипцами. Теперь разрежьте тонкую кишку на три равных сегмента, проксимальный, средний и дистальный, которые примерно соответствуют двенадцатиперстной кишке, тощей кишке и подвздошной кишке.

С макроскопической точки зрения, в каждом разделе нет различительных особенностей. Обязательно сделайте отметку, чтобы определить проксимальный конец от дистального на каждом сегменте. Затем поместите сегмент световой стороной вверх на крышку чашки Петри.

На сегменте толстой кишки определите просветную сторону по гребням, проходящим по ее ширине на проксимальном конце. Средняя и дистальная области имеют некоторые пестроты, которые идут продольно. На тонкой кишке определите просветную сторону по более шероховатой поверхности, которая отмечает ворсинки.

Микроскопическое исследование показывает, что ворсинки наиболее длинны в проксимальных областях каждого сегмента, в то время как крипты толстой кишки самые короткие в проксимальных областях и наиболее высоки в средней части. Приступаем к швейцарскому скручиванию двоеточия. Когда толстая кишка открыта и просветной стороной вверх, потяните ее щипцами от проксимального конца к краю чашки Петри.

Держа просветную сторону вверх, возьмитесь за проксимальный конец щипцами и оберните край проксимального конца вокруг зубочистки и плотно прижмите обернутый край к зубочистке. Затем аккуратно и медленно обкатайте двоеточкой вокруг зубочистки, чтобы получился швейцарский рулет. После того, как вся длина толстой кишки будет свернута, используйте еще одну пару щипцов, чтобы осторожно вставить рулон в кассету для обработки тканей.

Затем переложите кассету в 10-процентный буферный формалин и дайте ей инкубироваться в течение ночи при комнатной температуре. Чтобы скатать сегмент тонкой кишки, раскройте его просветной стороной вверх и потяните щипцами от проксимального конца к краю посуды. Затем используйте ту же технику, что и с двоеточием, чтобы сделать швейцарский рулет и зафиксировать его в формалине.

С помощью описанных методов окрашивание HND толстой кишки мыши C57 black 6 выявило все участки толстой кишки для всесторонней гистологической оценки. Затем препарат использовали для мышей, экспрессирующих EGFP, движимый промотором LGR5, который активен только в периферирующих кишечных криптах. Этот трансген EGFP имеет всего от 5 до 10 процентов пенетрантности, но области, представляющие интерес, могут быть легко найдены.

Используя тех же мышей с экспрессией EGFP LGR5, окрашивали KLF5 и KI67. Сначала были изучены контрольные мыши с нормальной экспрессией LGR5. EGFP-положительные клетки отмечены синими стрелками, а EGFP-отрицательные клетки отмечены белыми стрелками.

Затем те же трансгены были экспрессированы у мыши с нокаутом KLF5. Совместное окрашивание KLF5 и KI67 отсутствует в EGFP-положительных стволовых клетках, но остается присутствующим в EGFP-отрицательных криптах. Очевидно, что качество препарата для окрашивания мультифлюородугом очень хорошее.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за 15 минут на мыши, если вы собираете как тонкую кишку, так и толстую кишку. Не забывайте, что работа с фиксатором Буэна может быть чрезвычайно опасной для глаз. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как надлежащая защита глаз.

Спасибо за просмотр и хорошего взгляда с вашими экспериментами.