подтипов Campylobacter jejuni Подвид. doylei Изолятов Использование PhyloProteomics Масс-спектрометрия на основе (MSPP)

Общая цель этой масс-спектрометрической процедуры, называемой MSPP или филопротеомикой на основе масс-спектрометрии, заключается в выделении подтипов бактерий на уровне штамма. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области микробиологии, эпидемиологии и гигиены. Например, его можно использовать для анализа ситуаций вспышек путем визуализации филопротомической связанности.

По сравнению с другими методами типизации, MSPP дешев в расчете на образец и очень быстрый. Внутрибольничные инфекции приобретают все большее значение, и мы надеемся, что наша схема MSPP может быть расширена за счет эпидемиологического типирования других бактерий или даже грибков. Наша схема MSPP дает представление о родстве штаммов, поэтому для прогнозирования соответствующих фенотипов, таких как лекарственная устойчивость или даже вирулентность, имеет смысл применять ее там, где эти фенотипы коррелируют с конкретными генотипами.

Чтобы начать эту процедуру, приготовьте два тюбика матричного раствора, растворив 2,5 миллиграмм ГХК в 250 микролитрах смеси органических растворителей, 50% изонитрила. Добавьте к одному из них рекомбинантный человеческий инсулин в качестве внутренней калибровки, затем 47,5% двойной дистиллированной воды и 2,5% трифторуксусной кислоты. Затем распределите количество колонии размером с булавочную головку из эталонного штамма непосредственно на целевую пластину maldi.

Для определения точной массы калибровочного пика поместите на микролитр эталона в другое место. Посыпьте каждое пятнышко бактерий и стандарта 1 микролитром раствора шиповидной матрицы HCCA и оставьте их кристаллизоваться при комнатной температуре. Для каждого штамма, который нужно проанализировать, повторите подготовку мазка.

Посыпьте каждое пятно 1 микролитром шипучего раствора матрицы HCCA и оставьте кристаллизоваться при комнатной температуре. В качестве альтернативы, белки могут быть извлечены из клеток, которые трудно подлежать. Для этого соберите примерно 5 колоний из культуры агаровой пластины с петлей инокуляции.

Суспензируйте их в 300 микролитрах дважды дистиллированной воды в реакционной пробирке объемом 1,5 миллилитра и тщательно перемешайте путем повторного пипетирования до тех пор, пока колонии бактерий полностью не будут взвешены. Затем добавьте 900 микролитров абсолютного этанола и перемешайте. Центрифугируйте образец при давлении 13 000 г в течение 1 минуты.

После высыхания гранулы снова суспензируйте ее пипеткой вверх и вниз в 50 микролитрах 70% муравьиной кислоты. Затем добавьте 50 микролитров ацетонитрила и перемешайте. Удалите мусор центрифугированием при давлении 13 000 г в течение 2 минут.

Когда закончите, перенесите 1 микролитр суперназванного вещества в положение образца на целевой пластине maldi. Дав образцу высохнуть, посыпьте каждое пятно одним микролитром матричного раствора HCCA и оставьте кристаллизоваться при комнатной температуре. На этом этапе выполните анализ MALDI-TOF, собрав 600 спектров с шагом 100 выстрелов для каждого пятна.

Во-первых, нажмите на вкладку «Автовыполнение» в программном обеспечении для настройки масс-спектрометра. Откройте метод, щелкнув левой кнопкой мыши по кнопке метода и выбрав метод из выпадающего меню. Затем щелкните левой кнопкой мыши кнопку редактирования, чтобы открыть редактор методов автоматического выполнения.

На вкладке накопления установите удовлетворительное значение выстрела на 100, а суммарное значение на 600. Для каждого спектра выберите калибровочный пик из списка, нажмите «Автоматическое назначение» и нажмите «ОК»После получения масс-спектров из каждой точки экспериментально определите точную массу калибровочного пика, открыв спектр с помощью браузера спектров и найдя пик при ожидаемой массе по сравнению со спектром без калибра. Убедитесь, что пик калибра не закрыт каким-либо другим биомаркером интересующего организма.

На основе данных секвенирования генома референсного штамма рассчитать теоретическую моноизотопную молекулярную массу каждого из кодируемых белков путем трансляции последовательности ДНК в соответствующую аминокислотную последовательность. Загрузите файл или скопируйте эту белковую последовательность в поле ввода соответствующей панели ресурсов по биоинформатике и рассчитайте теоретическую изоэлектрическую точку и молекулярную массу. Скопируйте результаты в таблицу, в которой один столбец содержит идентификатор гена, а другой столбец — молекулярную массу.

Отсортируйте ряды по вычисленной молекулярной массе, чтобы облегчить поиск масс. Вставьте в таблицу дополнительный столбец для молекулярной массы дематианинированной формы, вычитая 135 даутонов из моноизотопной молекулярной массы. Присвойте каждому основному измеренному биомаркеру массу рассчитанной массы референсного штамма, просмотрев измеренную массу из таблицы генома.

В другой таблице запишите массу и идентификатор для каждого иона-биомаркера. Теперь откалибруйте масс-спектры, полученные из коллекции изолятов, как это было сделано для эталонного штамма. Для одного изолята в строке определите варианты биомаркеров в масс-спектрах, запишите измеренную массу для каждого биомаркера и прогнозируемую изоформу в соответствующих столбцах.

Масс-спектр MALDI-TOF подвида C-Jejuni doylei ATCC 49349 содержит 14 отдельно заряженных ионов-биомаркеров, которые могут быть идентифицированы путем сравнения рассчитанных молекулярных масс с референсным спектром. В рамках коллекции были обнаружены различные изоформы L32 без метионина, L33 и гипотетического белка, кодируемого gil152939117, S20 M и S15 M. Остальные массы, отнесенные к ионам-биомаркерам, были неизменными в испытуемых изолятах. Аминокислотная замена, соответствующая сдвигу массы, была идентифицирована с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования по Сэнгеру конкретного гена с использованием перечисленных здесь праймеров.

Здесь указаны аминокислотные последовательности всех ионов-биомаркеров, входящих в схему MSPP, а также обнаруженные изоформы алелиса. Дендрограмма UPGMA на основе MLST, построенная из исследованных изолятов дойлея подвида C jejuni, показывает, что каждый изолят принадлежит к другому типу последовательности MLST. А штамм LMG7790 имеет самую большую филогенетическую дистанцию.

Как видно на примере MLST alaysis, изолят LMG7790 имеет самое большое филопродеомическое расстояние в анализе MSPP исследованных изолятов C. jejuni подвида doylei. После освоения этой техники ее можно выполнить в течение одного дня, если она выполнена правильно. Следуя этой процедуре, важно помнить о токсичности некоторых веществ, используемых во время эксперимента.

Например, ацетонитрил может вызывать раздражение кожи. Кроме того, для MSPP могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование ДНК, для анализа дополнительных параметров, таких как наличие генов резистентности. Развитие этого метода открывает путь исследователям в области микробиологии к изучению фотогении.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как работает MSPP и как его можно применить к конкретным вопросам. Не забывайте, что работа с агрессивными патогенами может быть чрезвычайно опасной, и всегда следует принимать меры предосторожности, такие как лабораторное оборудование S2.