Методы острой и подострой мышиной ишемии задней конечности

Общая цель данного протокола заключается в моделировании заболевания периферических артерий человека путем наложения швов или установки амероидных констрикторов на бедренную артерию мыши для индукции острой или подострой ишемии конечности соответственно. Заболевание периферических артерий представляет собой важную клиническую проблему, и данные методы с использованием животных моделей были разработаны для более точного воспроизведения заболевания человека. Основным преимуществом этих методов является то, что исследователь может контролировать степень тяжести и время наступления ишемии конечности.

Процедуру продемонстрирует Майк Паджетт, техник из моей лаборатории. За один-два дня до процедуры убедитесь, что мышь полностью седирована (отсутствие реакции на зажим пальца лапы), и нанесите глазную мазь. Затем с помощью небольшого электрического триммера выбрейте шерсть на обеих задних конечностях.

После того как все волосы будут подстрижены, нанесите предварительно подогретый крем для депиляции. Через одну минуту осторожно удалите крем смоченным марлевым тампоном. Затем поместите мышь в клетку для восстановления, выстланную бумажными полотенцами, до тех пор, пока животное не сможет самостоятельно поддерживать положение лежа на груди.

В день операции поместите полностью седированную мышь в положение на спине под стереодиссекционный микроскоп Technic и зафиксируйте обе конечности хирургическим пластырем. При использовании нагревательной подушки с контролем температуры закрепите температурный датчик, прикрепив его к основанию хирургической платформы с помощью хирургического пластыря. Затем последовательно используйте три салфетки с повидон-йодом и спиртом для очистки места операции, после чего накройте животное стерильной хирургической салфеткой с отверстием в месте разреза.

С помощью скальпеля сделайте первый разрез по центру внутренней поверхности бедра от колена в сторону живота. Затем с помощью тонких ножниц удлините разрез примерно до одного сантиметра. Используя пинцет, расширьте разрез, чтобы обнажить мембрану, покрывающую паховую жировую ткань.

Затем с помощью закрытого пинцета проколите мембрану, проникнув в пространство между жировой тканью и брюшной полостью. Осторожно ослабьте сжатие пинцета, чтобы отделить жировую ткань от мышц брюшного пресса и обнажить нейроваскулярный пучок. Крайне важно правильно идентифицировать основные кровеносные сосуды и их ветви перед диссекцией нейроваскулярного пучка.

Вариации в расположении констрикторов или местах лигирования могут значительно изменить степень ишемии, что приведет к существенной вариабельности результатов. Вставьте ретрактор в разрез и отодвиньте ткани брюшной полости в сторону головы животного, чтобы обнажить место установки проксимального амероидного констриктора, который находится проксимальнее латеральной огибающей бедренной артерии. Затем вставьте один медиальный и один латеральный ретракторы в дистальную часть разреза, чтобы расширить операционное поле, отодвигая жировую ткань паховой области в сторону стопы и в сторону от места операции.

Проксимальные и поверхностные каудальные ветви бедренной артерии должны быть отчетливо видны. Латеральная огибающая ветвь бедренной артерии расположена примерно в пяти миллиметрах проксимальнее каудальных ветвей и может быть закрыта мембраной. Теперь аккуратно просуньте кончик одного пинцета под мембрану, соединяющую сосуды, чтобы ввести половину кончика между веной и артерией.

Затем закройте пинцет и осторожно удалите мембрану. Когда вся мембрана будет удалена, вставьте кончик закрытого пинцета между веной и артерией, а затем ослабьте захват пинцета, чтобы создать зазор между сосудами. При подострой ишемии конечности просуньте кончик пинцета под бедренную артерию, чтобы изолировать сосуд от нейрососудистого пучка.

Используйте второй набор угловых пинцетов, чтобы захватить край зажима, и проведите зажим под бедренную артерию. Затем поместите артерию в прорезь зажима. Далее расположите дистальный зажим на бедренной артерии непосредственно проксимальнее места ее разделения на подколенную и большую подкожную вены, и поместите бедренную артерию в прорезь зажима.

Для моделирования острой ишемии конечности проведите нить шва 7-0 под артерией в той же позиции, что и проксимальный констриктор, и перевяжите артерию. Затем наложите вторую лигатуру примерно в одном миллиметре дистальнее первой и с помощью пружинных ножниц пересеките артерию между двумя лигатурами. При дистальном пересечении артерии расположите лигатуры на расстоянии примерно одного миллиметра друг от друга, непосредственно проксимальнее места бифуркации бедренной артерии на подколенную и большую подкожную артерии.

Затем зашейте разрез прерывистыми швами с использованием викрила 5-0 и переместите мышь на нагревательную подушку с температурой 37 °C под лазерный допплеровский перфузионный имиджер. Включите имиджер и запустите программное обеспечение для захвата изображений. Нажмите значок New Single Image, чтобы открыть окно настроек сканера, установите размер сканирования Large, а скорость сканирования — 4 мс на пиксель.

Измените значения X и Y на панели единиц области сканирования (Scan Area) на соответствующие значения, затем перейдите на вкладку Видео и Дистанция (Video and Distance) и расположите обе задние конечности внутри области сканирования. Нажмите Автодистанция (Auto Distance), затем нажмите Далее (Next), чтобы открыть окно Сведения об объекте (Subject Details), и введите информацию об объекте. Нажмите Далее (Next), чтобы перейти к окну сканирования.

Затем нажмите кнопку Start Measurement, чтобы открыть диалоговое окно Confirm or Override Scan Distance, и нажмите OK для начала процесса сканирования. По завершении сканирования переместите мышь в пустую клетку для восстановления с мониторингом до полного восстановления животного. Помимо вариаций, присущих исследованиям на животных, на результаты лазерной допплеровской перфузионной визуализации могут влиять и другие факторы, включая температуру тела и положение животного.

Модель подострой ишемии нижних конечностей зависит от качества амероидных констрикторов, которое может существенно варьироваться внутри одной партии. Лазерную допплеровскую перфузионную визуализацию следует проводить сразу после процедуры, пока животное находится под воздействием анестезии, чтобы продемонстрировать эффекты операции и установить базовый послеоперационный уровень перфузии. После индукции острой ишемии конечности должна наблюдаться полная потеря перфузии нижних конечностей, тогда как в подострой модели после установки амероидного констриктора обычно наблюдается лишь умеренное снижение перфузии.

Данные процедуры позволяют изучить влияние различной степени ишемии на сосудистое ремоделирование и регенерацию скелетных мышц у мыши как модели периферического артериального заболевания человека. После освоения эти манипуляции могут быть выполнены примерно за 15 минут при условии их правильного проведения. Во время проведения данных операций важно постоянно контролировать температуру тела животного и адекватность анестезии.

Регулируя расположение лигатур или констрикторов, можно изменять степень тяжести ишемического повреждения, что может быть важным параметром в зависимости от генетического фона животного или наличия факторов сердечно-сосудистого риска. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как индуцировать острую и подострую ишемию задних конечностей у мыши, а также как определить анатомию сосудов для обеспечения правильного результата и воспроизводимости процедуры.