Генерация гуманизированное печени мышей с помощью печени человека стволовые клетки

Общая цель данной хирургической процедуры трансплантации стволовых клеток заключается в создании новой химерной модели мыши с функциями человеческой печени с использованием незрелых стволовых клеток-предшественников печени человека, что обеспечивает пролиферацию, созревание и дифференцировку клеток для приобретения способности к метаболизму лекарственных средств. Этот метод представляет собой мощный инструмент для создания микроокружения, поддерживающего прогенез стволовых клеток печени человеческого донора для их экспансии, дифференцировки и восстановления поврежденной печени мыши-реципиента. Основным преимуществом данной методики является возможность использования созревших пролиферированных клеток и почти полное заселение ткани печени.

Для начала приготовьте стоковый раствор дифтерийного токсина (DT) с концентрацией 1 mg/mL, добавив 1 mL 0,85% раствора хлорида натрия с фенолом к 1 mg DT. Выполните внутрибрюшинную инъекцию DT: зафиксируйте мышь Albtrek SCID в положении на спине и, ниже сгиба коленей слева или справа от срединной линии, введите иглу под углом 45 градусов к телу. С помощью инсулинового шприца введите 100 µL свежеприготовленного раствора DT с концентрацией 0,3 µg/mL на каждые 20 g веса мыши. Через 48 часов после инъекции DT поместите мышь в фиксатор и прогревайте хвост в водяной бане при температуре 30 °C в течение примерно 10 минут для расширения кровеносных сосудов.

Затем на расстоянии двух сантиметров от кончика хвоста с помощью острого лезвия скальпеля сделайте надрез хвоста глубиной один миллиметр и сберите кровь с помощью капиллярной трубки. Центрифугируйте микрокапиллярную трубку с кровью при 1500 ×g в течение пяти минут и соберите сыворотку, отделив супернатант от осадка клеток. Пипеткой нанесите 50 µL сыворотки в разведении 1:20 на предметные стекла GOT ASTP3.

Затем, используя многоцелевой автоматический анализатор сухой химии в соответствии с протоколом производителя, измерьте оптическую плотность продукта реакции при 650 нанометрах. С помощью клеточного сортера выделите стволовые клетки печени человека из первичных фетальных клеток печени человека по клеточным антигенам CDCP1, CD90 и CD66 для получения субпопуляции, положительной по CDCP1 и CD90 и отрицательной по CD66. Высейте клетки в культуральные чашки с коллагеном IV типа и инкубируйте при 37 градусах Цельсия.

Когда клетки достигнут 80–90% конфлюэнтности, промойте их один раз с помощью PBS. Затем добавьте 0,05% Trypsin EDTA и инкубируйте при комнатной температуре. Когда под микроскопом станет видно, что клетки начали открепляться или свободно перемещаться, остановите ферментативное расщепление, добавив восемь миллилитров среды DMF12, содержащей 10% FBS.

С помощью серологической пипетки на 10 мл медленно суспендируйте клетки перед их переносом в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при 100 ×g и 4 °C в течение пяти минут. Осторожно ресуспендируйте осадок клеток в 10 мл среды DMF12 с 10% FBS и определите количество клеток с помощью счетчика клеток.

Разделите клетки на аликвоты по 1 × 10⁶ клеток в 50 µL PBS для каждой мыши и храните на льду до момента трансплантации. После анестезии мыши согласно текстовому протоколу проверьте наличие рефлексов, слегка сжав подушечку задней лапы. Затем нанесите ветеринарную мазь на глаза для предотвращения пересыхания.

С помощью электрической машинки для стрижки выбрейте шерсть в месте проведения операции, затем обработайте кожу 70% ethanol и повидон-йодом для дезинфекции. Сделайте разрез кожи длиной один сантиметр в левом боку сразу под реберным краем. Затем сделайте разрез левой брюшной стенки с последующим разрезом брюшины.

Затем осторожно обнажите селезенку. После этого под углом пять градусов введите микрошприц объемом 100 µL с иглой калибра 32 и длиной 1/2 дюйма на глубину, равную половине толщины селезенки, и непосредственно в орган, перемещая иглу от одного конца органа к другому, введите 1 × 10⁶ человеческих печеночных стволовых клеток в 50 µL PBS, после чего извлеките иглу. Чтобы предотвратить вытекание клеток после инъекции, аккуратно прижмите место введения пальцем в течение двух минут.

Поместите селезенку обратно в тело мыши и наложите обычный простой шов на мышцы и кожу для закрытия полости. Немедленно перенесите мышь на бок в предварительно прогретую до 37 degree Celsius клетку. Избегайте контакта наполнителя клетки с местом хирургического вмешательства и наблюдайте за животным в соответствии с текстовым протоколом.

Через четыре-шесть недель после трансплантации, после эвтаназии мыши в соответствии с текстовым протоколом, с помощью хирургических ножниц раскройте брюшную полость, одновременно рассекая кожу и фасцию. Используя ножницы в качестве расширителя, препарируйте соединительную ткань над брюшиной вдоль белой линии (linea alba), чтобы открыть брюшную полость. С помощью пинцета приподнимите грудину.

Затем проколите диафрагму и разрежьте грудину с каждой стороны вверх до шейного пояса. Перережьте нижнюю полую вену со стороны грудной клетки в области печени и вытяните пищевод через печень в переднем направлении. Удалите диафрагму, а затем, используя её в качестве рукоятки, начните извлекать печень из брюшной полости.

Нижняя полая вена удерживает печень на месте. Поэтому перережьте нижнюю полую вену, стараясь не высвободить правый надпочечник преждевременно. Разделите доли печени друг от друга в местах их соединения и поместите их в OCT согласно протоколу производителя.

Заморозьте OCT, содержащий ткань печени, в металлических кассетах на криостате. С помощью криостата нарежьте образцы толщиной 5 µm при температуре -18 °C и нанесите их на предметные стекла комнатной температуры. Храните запасные образцы при температуре -80 °C.

Наконец, подготовьте стекла для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) в соответствии с ранее описанными процедурами, а также проведите анализ ELISA согласно текстовому протоколу. Как показано на этих срезах, окрашенных H&E, у мышей, получавших DT, наблюдалась дезорганизация структуры печени и признаки застоя с повышенной активностью АСТ в сыворотке крови. Через шесть недель после трансплантации клетки, производные от человеческих стволовых клеток печени, восстановили структуру печени, заместив резидентные гепатоциты мыши.

Макроскопически через четыре дня после трансплантации были обнаружены небольшие кластеры человеческих гепатоцитов, равномерно распределенные по печени. К 45-м суткам эти кластеры разрослись в крупные скопления. Как показано здесь, наличие человеческих гепатоцитов в печени мышей было впервые подтверждено через шесть недель после трансплантации путем окрашивания антителами к ядрам человека и цитокератинам 8/18.

Гепатоциты, положительные по человеческому ALB и отрицательные по CK19, напоминали функциональные гепатоциты, в то время как клетки с положительным ко-окрашиванием на человеческий ALB и CK19 проявляли бипотенциальную способность к дифференцировке в гепатоциты и холангиоциты. Было обнаружено наличие множественных округлых кластеров вокруг долей печени с четко выраженными человеческими ядрами и экспрессией CK8/18, что свидетельствует о способности человеческих стволовых клеток печени к формированию колоний в гуманизированной печени. Наконец, уровень репопуляции достиг 90% через один месяц после трансплантации, а в репопулированной печени мышей была обнаружена секреция человеческого альбумина.

После освоения техники хирургическая трансплантация клеток может быть выполнена за 10 минут при условии правильного проведения процедуры. При выполнении данной манипуляции важно помнить, что повреждение печени должно быть ограничено только донорской печенью. При утечке клеток трансплантацию следует прекратить.

В сочетании с данной процедурой могут быть применены другие методы, такие как трансфекция генов для прямого репрограммирования клеток человека in vitro, чтобы изучить конвергенцию человеческих клеток с нашей текущей моделью. После своей разработки эта методика открыла исследователям в области гепатологии путь к изучению метаболизма лекарственных средств, лекарственных взаимодействий, гепатотоксичности и вирусов гепатита на гуманизированной модели печени. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать и экспандировать печеночные стволовые клетки, индуцировать повреждение печени и трансплантировать клетки через селезенку для создания химерной модели мыши с функцией печени человека.

Не забывайте, что использование дифтерийного токсина требует строгого контроля, и при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, чтобы избежать некроза сердца и печени.