Поколение парабиотического эмбрионов данио рерио хирургическим путем Fusion разработки Blastulae

Общая цель этого метода заключается в создании парабиотических эмбрионов данио-рерио, которые могут быть использованы для изучения внутренних и внешних функций клетки для генов-кандидатов, представляющих интерес. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы автономии клеток. Например, в гематопоэтической системе жизненно важные дефекты миграции ГСК присущи ГСК или микроокружению ниши.

Основным преимуществом этого протокола является улучшенная способность успешно генерировать парабиотические эмбрионы данио-рерио. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что развивающиеся эмбрионы чрезвычайно хрупкие и легко повреждаются. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы хирургического сшивания могут быть сложными для освоения, поскольку они требуют высокой степени точности и аккуратности.

Здесь мы приводим пошаговые инструкции по созданию парабиотических эмбрионов данио-рерио путем хирургического слияния развивающихся бластул. Этот метод демонстрирует, как можно повысить эффективность парабиотических слияний и улучшить выживаемость сросшихся эмбрионов. После подготовки реагентов и инструментов в соответствии с текстовым протоколом приготовьте две-три модифицированные пастеровские пипетки, кратковременно нагрев конец пипетки над горелкой Бунзена.

Затем с помощью больших щипцов, пока он еще горячий, загните конец пипетки примерно на 45 градусов. Чтобы убедиться в отсутствии острых краев, которые могут повредить эмбрионы, держите конец пипетки над горелкой Бунзена в течение одной-двух секунд. Используя плазменную ДНК, мРНК или морфолино, микроинъекции эмбрионов в течение одного часа после сбора и позволяют им развиться до 256 клеточной стадии.

По мере того, как эмбрионы приближаются к стадии 256 клеток, переносите каждый генетический фон в отдельные чашки, покрытые агарозой, стеклянные стаканы без царапин или чашки Петри. После дехорионизации эмбрионов согласно текстовому протоколу разморозьте предварительно приготовленную метилцеллюлозу, и используйте настольную центрифугу на максимальной скорости для гранулирования нерастворенных кристаллов, которые повредят эмбрионы или разорвут желтки. Тем временем, используя маркер, отметьте от 12 до 15 заранее определенных пятен на нижней стороне чашки Петри, покрытой агарозой объемом 100 миллилитров.

Затем, после центрифугирования, используя прозрачную верхнюю фракцию метилцеллюлозы, перенесите от одной до 1,5 сантиметровой капли в отмеченные места в чашке Петри. Затем приготовьте одну аликвоту 40 миллилитров раствора с высоким содержанием кальция или HCR на только что приготовленное блюдо с агарозной оболочкой. К каждой аликвоте добавьте антибиотики, как указано здесь.

Когда будете готовы к выполнению слияний бластулы, используйте аликвоты HCR с антибиотиками, чтобы тщательно наполнить каждую посуду, содержащую капли метилцеллюлозы, стараясь не нарушить их. Подсоедините приготовленную ранее дозатор из модифицированного стекла пипетку Пастера к 10-миллилитровому насосу-пипетке. Затем под стереоскопом соберите по одному дехорионизированному эмбриону с каждого фона.

Перед тем, как выдать два эмбриона, с помощью пастеровской пипетки сделайте небольшое углубление в середине капли метилцеллюлозы. Затем поместите два эмбриона во впадину. Теперь, используя дразнящую иглу с гелевым наконечником на конце, используйте мягкие подметающие движения, не касаясь эмбрионов напрямую, чтобы осторожно переместить эмбрионы внутри метилцеллюлозы так, чтобы их животные полюса соприкасались друг с другом.

Правильная ориентация развивающихся эмбрионов определяет, как эмбрионы будут срастаться и развиваться. При сращивании голова к голове убедитесь, что каждый спондилодез выровнен по полюсам животного. Дайте эмбрионам посидеть пять минут, чтобы метилцеллюлоза остыла вокруг них.

За это время загрузите следующую пару в другой дроп. Чтобы выполнить операцию, используя инструмент со стеклянной иглой, осторожно намотайте каждый эмбрион в точке их контакта. Затем легкими швейными движениями вытяните клетки из первого эмбриона во второй эмбрион и обратно.

В конце движения удерживайте иглу на месте в течение двух-трех секунд, прежде чем очень медленно отвести ее. Точность обращения со стеклянной иглой имеет решающее значение для обеспечения правильного сшивания эмбрионов. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить желточные мешки, сохраняя при этом достаточное соединение для успешного сращивания.

Дайте эмбрионам постоять от 10 до 15 минут при комнатной температуре. Тем временем сшейте дополнительные пары эмбрионов. После инкубации оцените, остались ли эмбрионы прикрепленными, и при необходимости повторите этап ранения.

Инкубируйте эмбрионы в той же чашке и храните при температуре 28,5 градусов Цельсия в течение ночи. К утру следующего дня эмбрионы выйдут из большей части растворенной метилцеллюлозы. Удалите все эмбрионы, которые не смогли успешно срастись.

Затем сцедите среду и используйте 25 миллилитров Е3 для ее замены. Чтобы получить изображения сросшихся эмбрионов, приготовьте агарозу с низкой температурой плавления 0,8%. Пока еще горячая, добавьте 1 миллилитр агарозы в 1,5 миллилитровые микрофуговые пробирки, установленные в нагревательный блок при температуре 37 градусов Цельсия.

Обезболите парабиотические эмбрионы, добавив один миллилитр четырех мг на миллилитр рН 7,0 трикаина к 25 мл среды Е3, содержащей эмбрионы. Аккуратно перекрутите блюдо, чтобы эмбрионы скапливались в середине. Затем с помощью пластиковой пипетки для переноса с широким наконечником наберите эмбрионы в как можно меньшее количество жидкости.

Затем переверните пипетку вертикально и аккуратно подпрыгивайте эмбрионы, чтобы они осели на самое дно пипетки. Затем перенесите эмбрионы в 1 миллилитр аликвоты с низкой температурой плавления, слегка коснувшись кончика пипетки на поверхности агарозы. Утилизируйте лишнюю жидкость из пипетки и с помощью пипетки аккуратно перемешайте эмбрионы в агарозе.

Затем с помощью пипетки перенесите агарозу и зародыши в лунку со стеклянным дном шестилуночной пластины. Под стереомикроскопом используйте гелевый наконечник, прикрепленный к концу иглы, чтобы расположить эмбрионы близко к покровному стеклу и в желаемой ориентации для визуализации. После того, как агароза застыла и в лунки была добавлена среда с трикаином, используйте инвертированный широкопольный эпифлуоресцентный лазерный сканирующий конфокальный микроскоп или вращающийся дисковый конфокальный микроскоп для получения изображений.

Для полного поля зрения эмбриона используйте объектив с 4-кратным увеличением. Используйте 20-кратный объектив для изображения определенной ткани. Обрабатывайте изображения в соответствии с текстовым протоколом.

Как показано на рисунке, после ориентации двух бластул так, чтобы их животные шесты были обращены друг к другу, эмбрионы были осторожно ранены в точке их контакта. Большая степень ранения увеличивала вероятность сохранения связи между эмбрионами, что приводило к успешному слиянию без дополнительных морфологических дефектов или задержки развития. Как показано на этом рисунке, при ориентации двух бластул так, чтобы их животные полюса были выровнены, были получены надежные слияния головы к голове или желточного мешка с общей циркуляцией.

В большинстве случаев у эмбрионов было два сердца, перекачивающих общую циркуляцию. Чтобы подтвердить, что эмбрионы действительно разделяют свою циркуляцию, сросшиеся трансгенные эмбрионы, которые имели GFP-положительные эритроциты, были объединены с эмбрионами, которые имели mCherry-положительные сосудистые эндотелиальные клетки. Как видно из этого фильма, через 48 часов после оплодотворения наблюдалась циркуляция GFP-положительных эритроцитов через эмбрион-партнера Flik 1 HRAS mCherry.

Наконец, чтобы исследовать временной контроль экспрессии генов, одному из двух эмбрионов была введена конструкция ДНК hsp70 EGFP. После короткого 30-минутного теплового шока при температуре 37 градусов Цельсия в одном из эмбрионов был установлен четкий сигнал GFP, и в некоторых случаях GFP-положительные клетки циркулировали в эмбрионе партнера, которому не вводили инъекцию. После освоения этой техники ее можно выполнить за пять часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости быть осторожным при сшивании двух бластул вместе и вернуться к сращению, если операция не увенчалась успехом с первой попытки. После этой процедуры можно использовать дополнительные методы, такие как визуализация живых клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, могут ли ГСК дикого типа нормально функционировать в мутантной нише или, наоборот, могут ли мутантные ГСК функционировать в нише дикого типа. Этот метод предоставляет исследователям в области гематологии мощный метод изучения регуляции развития крови у рыбок данио.

Не забывайте, что трицинс может быть опасным, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующей защитной одежды. После просмотра этого видео и следования нашим рекомендациям мы надеемся, что вы сможете с большим успехом получить лучшие биотические эмбрионы данио-рерио.