Бесклеточной Анализ с помощью

Общая цель данной процедуры заключается в использовании экстрактов яйцеклеток и эмбрионов Xenopus для создания системы анализа, в которой крупные ядра уменьшаются в размере. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы клеточной биологии ядра, например, о механизмах, регулирующих размер ядра. Основным преимуществом данной методики является то, что состав и активность бесклеточного экстракта Xenopus легко поддаются манипуляциям для изучения факторов, влияющих на размер ядра.

После приготовления экстрактов ядер икрин Xenopus, демембранированных сперматозоидов и собранных ядер согласно текстовому протоколу, соберите свежеотложенные икринки, удерживая лягушек над стеклянной многоразовой чашкой Петри. Стимулируйте откладку икры, осторожно надавливая на нижнюю часть спины в области клоаки. Установите чашку под углом примерно 45 градусов, чтобы икринки скапливались у ее края.

Затем удалите излишки буфера и добавьте достаточное количество 1/3X MMR, чтобы они едва покрывали икринки. Используя плотно прилегающий пестик, растереть и гомогенизировать 1/4 семенника в пробирке объемом 1,5 мл с 500 µL модифицированного раствора Барта с высоким содержанием солей (MBS). Затем добавьте гомогенизат семенника к икринкам и оставьте для оплодотворения при комнатной температуре на 15 минут.

После инкубации залейте икру раствором MMR в концентрации 1/3X. Затем, через 5–10 минут, подтвердите факт оплодотворения, проверив сокращение темного пигментированного анимального полюса и перевернув эмбрионы анимальным полюсом вверх. С помощью пластиковой пипетки с широким отверстием тщательно удалите погибшие, лизированные или неоплодотворенные недробящиеся икринки, так как они могут быстро вызвать гибель соседних эмбрионов.

В интервале от 1 до 2,5 часов после оплодотворения проведите удаление желеистой оболочки эмбрионов в растворе цистеина (2–3%), растворенного в 1/3 X MMR с доведенным значением pH 7,9. До удаления желеистой оболочки эмбрионы занимают относительно большой объем. Выполните две смены буфера, каждую по три-четыре минуты.

Затем тщательно промойте эмбрионы, 6–10 раз быстро заменив раствор 1/3 X MMR, чтобы удалить все следы цистеина. После удаления слизистой оболочки эмбрионы плотно прилегают друг к другу и занимают относительно небольшой объем. Затем с помощью стеклянной пипетки с широким отверстием перенесите здоровые оплодотворенные эмбрионы в чашку Петри со свежим раствором 1/3 X MMR.

Оставьте их при комнатной температуре до достижения желаемой стадии развития. Продолжайте удалять погибшие или лизированные эмбрионы, которые определяются отсутствием первого деления или белым рыхлым видом. Когда эмбрионы достигнут стадии 11.5–12, перенесите их в свежую одну треть среды X MMR с добавлением 0.5 mM циклогексимида и инкубируйте эмбрионы при комнатной температуре в течение одного часа для их остановки в поздней интерфазе.

С помощью стеклянной или пластиковой пипетки с широким отверстием перенесите не менее 15 эмбрионов, заблокированных в интерфазе, в микроцентрифужную пробирку. Добавьте к эмбрионам один миллилитр буфера для лизиса яйцеклеток (ELB), дополненного одним микролитром стокового раствора LPC. Осторожно переверните пробирку, чтобы промыть эмбрионы.

Затем дайте эмбрионам осесть на дно пробирки. Перед удалением буфера повторите промывку еще два раза. Ресуспендируйте эмбрионы в 500 µL ELB, добавив 0.5 µL стокового раствора LPC, 5 µL 19.7 mM циклогексимида и 5 µL 35.5 mM цитохалазина D для ингибирования полимеризации актина.

Центрифугируйте образцы в настольной центрифуге при 200 ×g в течение одной минуты, затем удалите избыток буфера и с помощью пестика тщательно раздавите эмбрионы. Поместите раздавленные образцы в ротор с качающимися стаканами и центрифугируйте при 10 000 ×g и 16 °C в течение 10 минут. Кончиком пипетки объемом 200 µL проколите липидный слой сверху, а затем, используя чистый наконечник пипетки, перенесите средний цитоплазматический слой янтарного цвета в пробирку соответствующего размера.

Добавьте в экстракт эмбрионов следующие реагенты. Затем осторожно переверните пробирку для перемешивания. После визуализации эндогенных ядер эмбрионов в экстракте путем приготовления препарата-давилки согласно текстовому протоколу, удалите ядра из экстракта, предварительно добавив равный объем буфера ELB, содержащего перечисленные здесь реагенты.

Осторожно переверните пробирку для перемешивания. Центрифугируйте образец в роторе с навесными стаканами при 17,000 ×g и температуре 16 °C в течение 15 минут. Затем соберите супернатант, стараясь не задеть остатки липидов в верхней части, не потревожив осадок ядер на дне.

Приготовьте препарат методом раздавливания (squash), как описано в текстовом протоколе, чтобы убедиться, что большая часть ядер была удалена. Затем используйте свежий экстракт или разлейте образец по аликвотам и храните его при температуре -80 °C. Выделите ядра, собранные в яичном экстракте, разбавив от 25 до 150 µL предварительно собранных ядер в 1 mL буфера ELB в пробирке объемом 1.5 mL.

Центрифугируйте при 1600 ×g и четырех градусах Celsius в течение трех минут. Затем удалите буфер, стараясь не потревожить осадок. Добавьте к осадку объем экстракта эмбрионов, равный исходному объему экстракта яйца, и аккуратно постучите по пробирке, чтобы разрушить осадок и ресуспендировать ядра.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение 90 минут, осторожно постукивая по пробирке для перемешивания каждые 15–30 минут. После инкубации постучите по пробирке, чтобы ресуспендировать ядра непосредственно перед добавлением 500 µL буфера ELB с 15% glycerol и 2.6% Paraformaldehyde. Сразу же переверните пробирку и поместите ее на ротатор при комнатной температуре на 15 минут.

Подготовьте центрифужные пробирки, поместив пластиковые вставки с закругленным дном в стеклянные пробирки с закругленным дном объемом 15 миллилитров. Добавьте 5 миллилитров буфера для ядерной подушки, затем аккуратно опустите в пробирку кругное покровное стекло диаметром 12 миллиметров, убедившись, что оно плотно лежит на пластиковой вставке. С помощью наконечника для пипетки с широким отверстием осторожно нанесите раствор фиксированных ядер поверх ядерной подушки.

Центрифугируйте образец в роторе с поворотными стаканами при 1, 000 ×g и 16 °C в течение 15 минут. Затем с помощью аспиратора удалите весь буфер, придерживая пластиковую вставку у верхней части пробирки. После этого с помощью тонкого пинцета извлеките покровное стекло, стараясь запомнить сторону стекла, на которую осели ядра.

Зафиксируйте объектное стекло в холодном метаноле в течение пяти минут при комнатной температуре. Перенесите предметное стекло стороной с ядрами вверх на лист пластиковой парафиновой пленки, застилающей большую пластиковую чашку Петри. Затем поместите влажные одноразовые салфетки по краям чашки, чтобы предотвратить дегидратацию.

Используя 500 µL PBS NP40, регидратируйте ядра на покровном стекле в течение пяти-десяти секунд, затем удалите раствор путем аспирации. После этого осторожно нанесите на покровное стекло 75 µL PBS 3%BSA и оставьте для блокировки при комнатной температуре на один час или при 4 °C на ночь. Удалите блокирующий буфер и проведите инкубацию с первичными антителами, разведенными в PBS 3%BSA.

Затем промойте образцы, пять раз последовательно заменив раствор PBS NP40. Повторите эти этапы инкубации и промывки с вторичными антителами. Инкубируйте с Hoechst в концентрации 10 µg/mL, разведенным в PBS 3%BSA, в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем пять раз промойте образцы буфером PBS NP40 и удалите весь излишек буфера. В завершение зафиксируйте покровное стекло на предметном стекле, используя 5 µL среды для монтажа с антифейдинговым агентом. Герметизируйте края покровного стекла бесцветным лаком для ногтей и сразу же проведите визуализацию с помощью эпифлуоресцентного микроскопа или храните при 4 °C для последующей визуализации.

На этом рисунке показана сборка ядер в экстракте яйца. Через 30-45 минут после начала реакции тонкие S-образные сперматозоидные ядра должны начать утолщаться, превращаясь в хроматиновые массы слизеподобной формы. После завершения сборки ядра их форма должна стать более округлой, а объем ядер должен увеличиться по мере расширения ядерной оболочки и импорта ядерных белков.

Как показано здесь, при подготовке препарата-раздавливания небольшой аликвоты экстракта эмбриона, окрашенного красителем Hoechst, наблюдается множество окрашенных ядер, что свидетельствует об успешном приготовлении экстракта. После удаления ядер путем центрифугирования, по сравнению с первым препаратом, в экстракте должно остаться очень мало ядер, что видно на данной панели; это гарантирует, что эндогенные ядра не будут препятствовать последующему анализу. Если ядра все еще присутствуют, требуется повторный цикл центрифугирования.

В данном анализе сокращения объема ядер nuclei, ресуспендированные в экстракте эмбриона поздней стадии, со временем успешно уменьшаются в размере. Однако ядра, инкубированные с термоинактивированным экстрактом эмбриона, этого не делают. Повторение эксперимента несколько раз важно для учета присущей данному анализу вариабельности.

После освоения всего протокола его выполнение занимает два дня, при этом сам анализ сморщивания ядер длится примерно четыре часа. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости постоянного контроля качества яйцеклеток и эмбрионов, а также проявлять осторожность при сборе цитоплазматического экстракта после центрифугирования, чтобы не задеть осадок и липидные слои. Результаты, полученные с помощью данной методики, должны быть валидированы.

Например, микроинъекция эмбрионов или трансфекция клеточных культур. Кроме того, данный метод может быть использован для изучения регуляции размеров других органелл. После своей разработки эта методика открыла исследователям в области биологии клеточного ядра путь к изучению регуляторных механизмов размера ядра, а также функциональной роли размера ядра в процессах развития и канцерогенеза.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как собирать и выделять ядра из экстракта яиц Xenopus, получать эмбрионы Xenopus и экстракт эмбрионов, проводить анализ сморщивания ядер и визуализировать результаты.