Малоберцового нерва Метод Травма: Надежный Анализ для идентификации и испытания факторов, которые Ремонт нервно-мышечных синапсах

Мы разработали метод повреждения нервов для надежного изучения реиннервации мышц и, следовательно, регенерации нервно-мышечных соединений у мышей. Этот метод включает в себя повреждение общего малоберцового нерва с помощью простой и легко воспроизводимой операции. Затем оценивается реиннервация мышц путем цельного монтажа разгибателя длинной мышцы пальца ноги.

Общая цель этого метода повреждения периферических нервов заключается в надежном исследовании регенерирующих нервно-мышечных соединений у мышей. Этот метод поможет нам выявить молекулярные, клеточные и функциональные изменения, связанные с регенерацией нервно-мышечных соединений. Основное преимущество данной процедуры заключается в том, что скорость регенерации нервно-мышечного перехода может быть надежно сопоставлена между экспериментальными группами в основном при отсутствии миогенных изменений.

Демонстрировать процедуру будет Уильям Далкин, студент-медик в моей лаборатории. Перед началом процедуры используйте 80% этанол для очистки хирургического поля, доски и инструментов, а затем продезинфицируйте их повидон-йодом. Затем поместите мышь на операционную доску и подтвердите отсутствие реакции на защемление пальца ноги.

Выровняйте конечности в пределах фиксаторов с целевой задней конечностью в анатомически естественном положении, а коленные суставы слегка вытянуты без внутреннего или внешнего вращения. Затем перенесите животное под хирургический микроскоп и отрегулируйте доску до тех пор, пока костный коленный сустав и гребень между передней большеберцовой мышцей и икроножной мышцей не станут видны через объектив. С помощью скальпеля и щипцов сделайте примерно трехсантиметровый разрез через кожу, перпендикулярно основному ходу общего малоберцового нерва.

Продолжайте разрез через поверхностную фасцию, обнажая бицепс бедра и латеральные мышцы широкой мышцы, а затем сделайте разрез на один-два сантиметра через соединительную глубокую фасцию для разделения мышц. Затем с помощью механических ретракторов отступите каудально двуглавой мышцы бедра, чтобы выявить общий малоберцовый нерв. Проведите нерв проксимально до тех пор, пока не будет найдено его пересечение с сухожилием латеральной головки икроножной мышцы.

Затем с помощью тонких щипцов захватите нерв, выравнивая кончики параллельно латеральной границе сухожилия икроножной мышцы, и приложите устойчивое, концентрированное давление в течение пяти секунд, чтобы раздавить общий малоберцовый нерв. Удерживая щипцы перпендикулярно волокну, захватите ткань областью сразу за кончиком щипцов и надавите сильно, но мягко для чистого, линейного сдавливания нерва вдоль границы сухожилия. Визуально осмотрите нерв через операционный микроскоп, чтобы подтвердить полное раздавливание ткани.

Нерв будет казаться полупрозрачным в месте травмы. Если использовать мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в периферических аксонах, флуоресценция исчезнет из места повреждения. Если нерв был достаточно поврежден, удалите ретракторы и выровняйте мышцы в их анатомическом положении.

Затем с помощью шелковых швов 6-0 закройте место разреза одним-тремя простыми прерывистыми швами и поместите мышь на грелку в чистую клетку с наблюдением до полного восстановления. Сжатие нерва в течение пяти секунд с помощью тонких щипцов приводит к исчезновению YFP из места травмы. Эпиневриум остается смежным, служа каналом для точной регенерации аксонов к их первоначальным целям.

У 70-дневных самок мышей повреждение нерва достаточно, чтобы вызвать дегенерацию всех аксональных сегментов, расположенных дистальнее нейрональной сомы, через четыре дня после раздавливания. Через семь дней после раздавливания нервные окончания активно занимают освободившиеся постсинаптические участки. На 12-й день нервные окончания продолжают дифференцироваться в пресинаптические участки, а нервно-мышечные соединения полностью восстанавливаются.

Существует небольшая вариабельность среди мышей, подвергшихся денервации в течение одного и того же периода времени, что свидетельствует о том, что дробление малоберцового нерва может быть использовано в качестве анализа для сравнения ренервации мышц у животных того же возраста и пола. Как и ожидалось, ряд изменений происходит в альфа-моторных аксонах, поскольку они восстанавливают мышечные волокна. Конусы роста аксонов расширяются и разветвляются по мере контакта с пост-синаптическими участками, увеличиваясь в определенных областях пост-синапса и достигая кульминации в почти полном сопоставлении аксональных окончаний с пост-синаптическими участками.

Как показано с помощью количественной ПЦР, гены, связанные с нервно-мышечными соединениями, увеличиваются после денервации и уменьшаются по мере восстановления нервно-мышечных соединений. После освоения этой техники ее можно выполнить за 15 минут, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не торопиться, визуализировать все структуры и дважды проверить, что было получено полное разрушение.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как QPCR, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, какие гены повышаются или понижаются. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению регенерации синапсов у мышей. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как выполнять сдавливание малоберцового нерва, чтобы изучить скорость ренервации нервно-мышечного соединения у мышей.