Генерация и идентификация GM-CSF производный альвеол, как макрофаги и дендритные клетки из костного мозга мыши

Общая цель данной процедуры заключается в получении и различении альвеолярно-подобных макрофагов и дендритных клеток в культурах клеток костного мозга мыши in vitro, дополненных GM-CSF. Этот метод in vitro позволяет ответить на ключевые вопросы, касающиеся функций дендритных клеток или макрофагов. Основным преимуществом данной методики является возможность получения достаточного количества клеток и возможность дифференциации дендритных клеток и альвеолярно-подобных макрофагов.

Значимость данной методики может распространяться на терапию альвеолярного протеиноза, поскольку она облегчает получение макрофагов, подобных альвеолярным, которые могут быть использованы для лечения этого заболевания. В целом, специалистам, впервые применяющим этот метод, потребуется практика по выделению очищенных костей и промыванию костного мозга. Визуальная демонстрация данного метода полезна, так как не все приемы легко понять только по письменным инструкциям.

За 15 минут до начала диссекции включите шкаф биологической безопасности для очистки воздуха в камере и стабилизации воздушного потока, затем очистите поверхность шкафа 70% ethanol. Когда шкаф будет готов, поместите мышь в положении лежа на животе на одну-две бумажные салфетки и распылите на животное 70% ethanol. Затем недоминирующей рукой приподнимите кожу в области грудной клетки и с помощью ножниц сделайте разрез.

Захватив оба края разреза, аккуратно потяните за них, пока два края разреза не сойдутся в области желудка. Затем переведите мышь в положение на спине и одной рукой оттяните нижнюю половину кожи вниз, пока не обнажатся конечности. Удерживая стопу, перережьте ахилловы сухожилия выше голеностопного сустава и связки, соединяющие мышцы со стопой в нижней части большеберцовой кости, чтобы освободить стопу от костей ноги.

Удерживая ногу в приподнятом положении, удалите мышцы и связки вокруг коленного сустава в нижней части бедренной кости, чтобы отделить мышцы бедра от голени. С помощью пинцета осторожно оттяните освобожденные мышцы от поверхностей малоберцовой и бедренной костей. Затем, прижав раскрытые ножницы к тазобедренному суставу, поверните ногу и аккуратно потяните за бедренную кость, чтобы отделить кость ноги от тазобедренного сустава, полностью отделяя ногу от тела.

Теперь, удерживая ногу за тазобедренный сустав стерильным пинцетом, с помощью другого пинцета удалите стопу за голеностопный сустав. Затем, удерживая одним пинцетом дистальный конец бедренной кости, а другим — проксимальные концы большеберцовой и малоберцовой костей, осторожно согните большеберцовую и малоберцовую кости в направлении, противоположном сгибу коленного сустава, чтобы отделить голень от бедренной кости и надколенника. Используйте пинцет, чтобы удалить оставшиеся связки, мышцы и малоберцовую кость от костей голени, и поместите очищенную большеберцовую кость на перевернутую крышку чашки Петри, содержащую 1–2 mL HBSS/FCS.

Зафиксировав нижний конец бедренной кости одним пинцетом, а надколенник — другим, согните колено и окружающие ткани в противоположную сторону, чтобы извлечь сустав. Затем удалите все оставшиеся соединительные ткани с бедренной кости и поместите кость на перевернутую крышку чашки Петри. После сбора всех костей с помощью пинцета удалите остатки тканей, прикрепленных к костям, и погрузите кости в 10 миллилитров HBSS/FCS в основание чашки Петри.

Прикрыв чашку стерильной крышкой для частичной защиты, разрежьте каждую из очищенных костей пополам ножницами. Затем с помощью одномиллилитрового шприца, оснащенного иглой 26,5G, промойте конец каждого фрагмента кости 1 мл HBSS/FCS из чашки до полного извлечения всего красного костного мозга. Несколько раз пропустите любые видимые комочки костного мозга через шприц для получения суспензии одиночных клеток, после чего тщательно перемешайте содержимое с помощью 10-миллилитровой пипетки.

Перенесите клетки в пробирку для сбора и один раз промойте чашку Петри пятью миллилитрами HBSS/FCS, чтобы собрать оставшиеся клетки. Затем объедините промывочный раствор в пробирке и поместите клетки на лед. Для постановки культуры клеток костного мозга центрифугируйте собранные клетки и удалите супернатант с помощью стерильной стеклянной пипетки Пастера, подключенной к вакуумному отсасывателю.

Разрыхлите осадок, богатый эритроцитами, легким постукиванием. Затем добавьте 10 milliliters буфера для лизиса эритроцитов и ресуспендируйте клетки с помощью вортекса. После пятиминутной инкубации при комнатной температуре остановите лизис, добавив 10 milliliters HBSS/FCS, и центрифугируйте клетки, ресуспендировав осадок в среде для клеток костного мозга.

Подсчитайте количество жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего и перенесите необходимое количество клеток в новую пробирку с питательной средой для клеток костного мозга. Затем осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте осадок в питательной среде для клеток костного мозга с добавлением 20 ng/mL GM-CSF до концентрации 4 млн клеток/mL. Далее добавьте по 9,5 mL питательной среды для клеток костного мозга, содержащей 20 ng/mL GM-CSF, в каждую стерильную бактериологическую чашку Петри и внесите по 500 µL клеточной суспензии в центр каждой чашки.

Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2. На третий день добавьте в каждую культуру 10 мл свежей среды для костного мозга, дополненной GM-CSF в концентрации 20 нг/мл, стараясь максимально избегать беспокойства клеток. На шестой день осторожно перенесите 10 мл супернатанта клеточной культуры в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.

Центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадок в 10 миллилитрах свежей среды для клеток костного мозга, содержащей 20 нанogram на миллилитр GM-CSF. Затем осторожно перемешайте клеточную суспензию на вортексе и перенесите клетки обратно в чашку для культивирования. В первый день клетки костного мозга мелкие и немногочисленные, но к третьему дню их количество и размер увеличиваются, и некоторые из них начинают прикрепляться.

К шестому дню количество клеток увеличивается, и наблюдаются как адгезивные, так и неадгезивные фракции. Сбор культуры возможен с седьмого по десятый день; при этом отбор по размеру и жизнеспособности клеток показывает, что в культурах десятого дня содержится более высокий процент CD11c-положительных клеток. На седьмой день собранная неадгезивная фракция значительно обогащена клетками с дендритной морфологией.

Популяции CD11c-положительных и GR1-отрицательных клеток, собранные на седьмой и десятый дни, могут быть разделены на три основные группы: макрофаги, незрелые дендритные клетки и зрелые дендритные клетки, исходя из экспрессии MHCII и связывания FL-HA. Примечательно, что MerTK, хотя и считается маркером макрофагов, демонстрирует выраженную экспрессию как в популяциях макрофагов, так и в популяциях незрелых дендритных клеток, собранных на седьмой и десятый дни, в то время как в зрелых дендритных клетках наблюдается низкий уровень экспрессии.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости соблюдения правил стерильности на всех этапах забора костного мозга и культивирования клеток. После проведения этой процедуры клетки также можно подвергнуть сортировке для раздельного изучения клеточных популяций или стимулировать воспалительными агентами с последующим анализом продукции цитокинов с помощью внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать клетки костного мозга и культивировать их в среде с GM-CSF для получения как дендритных клеток, так и альвеолярно-подобных макрофагов.