Полиэлектролита Комплекс для гепаринсвязывающий домена Остеогенная фактор роста Доставка

Общая цель этой процедуры заключается в изготовлении оболочки полиэлектролитного комплексообразования. Носитель, который может захватывать и регулировать высвобождение широкого спектра факторов роста с гепарин-связывающим доменом. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области ортопедической тканевой инженерии для эффективного захвата и доставки выделенных факторов роста.

Основным преимуществом данной методики является то, что она не требует частого использования органики. Который, как известно, влияет на биоактивность факторов роста. Растворите 200 мг необлученного альгината натрия или 400 мг облученного альгината натрия с восемью мегарадами в 10 мл двойной дистиллированной воды.

И встряхивать в течение часа. Храните раствор альгината при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Перед изготовлением альгинатных микрогранул отфильтруйте раствор альгината с помощью стерильного шприцевого фильтра 0,2 микрона.

Продезинфицируйте электростатический генератор БЭ и шприцевой насос 70% этанолом и поместите их в шкаф биологической безопасности второго класса. Затем поместите внутрь генератора БЭ стеклянный таз с магнитной мешалкой. Установите электрод манипулятора генератора БЭ на высоте девяти сантиметров над бассейном.

Подсоедините электродный кабель генератора БЭ к нейровинту два электрода руки. И наливаем в таз 80 миллилитров раствора хлорида стронция. Далее загрузите пять миллилитров 0,2 микрона отфильтрованного раствора альгината в шприц в резиновой трубке.

После подключения резиновой трубки к электроду руки включите шприцевой насос со скоростью пять миллилитров в час. На две минуты. Для вытеснения воздуха внутри трубки и подачи раствора альгината на кончик сопла.

Затем выключите шприцевую помпу. Чтобы начать генерацию микрогранул, установите инкапсулятор на 5,8 киловольт. Далее следует шприцевой насос со скоростью расхода альгината пять миллилитров в час.

Выбросьте микрогранулы, образующиеся в течение первых двух минут, так как эти микрогранулы, как правило, имеют неправильный размер и форму. Соберите последующие микрошарики в 0,2 молярного раствора хлорида стронция. Выключите шприцевой насос, а затем капсулятор.

После откачки запланированного объема раствор альгината. Повторите это для последующих партий производства микрогранул. Храните микрогранулы в 20 миллилитрах 0,2 молярного раствора хлорида стронция при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи для полного сшивания и стабилизации геля.

Соберите 0,5 миллилитров альгинатных микрошариков с помощью пластиковой пипетки. И поместите его на предметное стекло. Рассматривайте микрошарики под оптическим микроскопом при 10-кратном увеличении.

Сделайте 10 снимков микрошариков с помощью ПЗС-камеры микроскопа. Сохраните изображения с помощью масштабной линейки 500 микрон в формате TIFF с разрешением 2048 на 1536. С помощью инструментов длины на изображении J измерьте размер микрошариков.

И масштабная линейка. Затем конвертируем длину микрогранул из пикселей в микрометры. Нажмите на инструмент «Линия» и нарисуйте линию поперек середины альгинатной бусины.

Нажмите «Анализ» в строке меню и выберите «Измерить». Появится всплывающее окно. Повторите эти шаги, чтобы измерить все альгинатные бусины на изображении.

Измерьте масштабную линейку на изображении. Соберите микрошарики с помощью нейлонового фильтра 100 микрон. И вымойте бусины двойной дистиллированной водой.

С помощью шпателя переложите все микрошарики, изготовленные из 0,1 миллилитра раствора альгината, в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку и накройте марлей для предотвращения высыхания. Наконец, простерилизуйте микрогранулы путем автоматического расщепления в жидкостном режиме или в соответствии со спецификациями производителя. Добавьте в камеру 1,5 литра дистиллированной воды, чтобы не допустить высыхания бусин.

Внутри вытяжки BSL2 инкубируйте стерильные микрогранулы с одним миллилитром стерилизованного раствора протамина в двух миллиграммах на миллилитр в течение одного часа при комнатной температуре. Промойте микрошарики, покрытые протамином, дважды двойной дистиллированной водой. Затем уменьшите скорость вращения с помощью настольной центрифуги при 200-кратном перегрузке в течение трех минут при комнатной температуре.

После центрифугирования отсасывайте воду с помощью шприца. Инкубируйте микрошарики, покрытые протамином, с одним миллилитром стерилизованного 0,5 миллиграмма на миллилитр раствора гепарина в течение 30 минут. В результате создается полиэлектролитная комплексообразовательная оболочка с высоким сродством к гепарин-связывающим факторам роста.

После инкубации отсасывайте гепрен с помощью шприца. И смыть несвязанный гепарин из полиэлектролитных комплексов путем двукратной промывки двойной дистиллированной водой. Загрузите 13,3 микролитра 1,5 мг на миллилитр костного морфогенетического белка 2 или раствора молекулы NELL 1 на 100 мкг полиэлектролитного комплекса.

Инкубируйте полиэлектролитный комплекс при четырех градусах Цельсия при 30 об/мин, встряхивая в течение 10 часов. Затем погрузите микрогранулы в один миллилитр фосфатно-солевого буфера, или PBS, при температуре 37 градусов Цельсия при постоянном встряхивании. Соберите один миллилитр надосадочной жидкости и замените ее на один миллилитр PBS через один, три, шесть, 10 и 14 дней.

Оцените эффективность поглощения и высвобождения NELL как молекулы один, используя метод анализа белка CBQCA в соответствии с протоколом производителя. Как вариант, проведите идуду. Биологическая активность NELL подобной молекулы, высвобождаемой из полиэлектролитного комплекса, оценивается путем измерения его способности увеличивать экспрессию щелочной фосфатазы в стволовых клетках костного мозга кролика.

Засейте 20 000 стволовых клеток костного мозга кролика в лунку в 24-луночном планшете. И дайте им вырасти в течение одного дня с помощью одного миллилитра модифицированной среды дульбекко плюс 10% эмбриональной бычьей сыворотки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. Через 24 часа замените среду одним миллилитром остеогенной среды на семь дней при температуре 37 градусов Цельсия.

И 5% CO2. Поместите 300 микрограммов полиэлектролитного комплекса и полиэлектролитного комплекса NELL, как молекула один, внутрь вкладышей клеточных культур, чтобы отделить комплексы от клеток. Вставьте вставку в 24-луночную пластину, чтобы избежать вымывания микрогранул полиэлектролитного комплекса при смене остеогенной среды.

Раз в три дня отсасывайте один миллилитр остеогенной среды, поместив иглу за пределы вкладыша. И заменить на один миллилитр свежей остеогенной среды. После 7 и 14 дней инкубации определите активность щелочной фосфатазы с помощью набора для анализа щелочной фосфатазы.

В соответствии с протоколом производителя комплекта. Упакуйте полиэлектролитные комплексы в поры биорезорбируемого медицинского каркаса поликапролактона трикальцийфосфата. С помощью стерилизованного шпателя внутри камеры BSL2.

Добавьте 1,5 миллиграмма или миллилитра раствора костного морфогенетического белка два или молекулы NELL один на каркас, заполненный полиэлектролитным комплексом. И инкубировать в течение ночи при 4 градусах Цельсия. Альгинатные микрогранулы исследуются под микроскопом для контроля их размера и морфологии.

Необлученные альгинатные микрогранулы имеют сферическую форму, а облученный аналог имеет каплевидную форму. Распределение по размерам является важным фактором поглощения факторов роста. А уменьшение размера увеличивает соотношение поверхности к площади.

При измерении альгинатных микрогранул с помощью программного обеспечения image J в среднем 100 микрогранул дают хорошую оценку распределения размеров в каждом совпадении микрогранул. Поскольку поглощение фактора роста зависит от правильной техники нанесения покрытия, толщина слоя каждого покрытия контролируется с помощью конфокальной микросопи. Здесь показаны конфокальные лазерные сканирующие микроскопические изображения альгинатных микрогранул, инкубированных с флуоресцентными аналогами протамина, гепарина, NELL как молекулы 1 и костного морфогенетического белка 2.

Активность щелочной фосфатазы используется для измерения биологической активности высвобождаемого фактора роста. Увеличение активности щелочной фосфатазы в 2,2 раза наблюдалось после инкубации с полиэлектролитным комплексом NELL как молекула 1 на 14-е сутки. После освоения этой техники ее можно выполнить в течение пяти часов, если она выполнена правильно.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что концентрация альгината влияет на стабильность микрогранул. Для облученных альгинатов нам требовалось четыре процентных показателя. Для необлученных аналогов нам требовался двухсторонний процент.

Следуя этим процедурам, мы можем еще больше увеличить нагрузку фактора роста за счет многослойного покрытия. Этот метод позволяет исследователям в области тканевой инженерии изучать доставку фактора роста в других моделях заболеваний. После просмотра этого видео вы сможете изготовить полиэлектролитный комплекс с узким распределением по размерам.