Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии

Общая цель данного анализа — определить влияние интересующих воздействий на клеточную адгезию в условиях напряжения сдвига. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области сигналинга иммунных клеток, например, какие факторы опосредуют активацию интегринов. Основным преимуществом данной методики является возможность изучения отдельных пар молекул адгезии интегринов в легко воспроизводимой системе потока.

Хотя данный метод позволяет получить представление об активации LFA1, его также можно применять для изучения других интегринов. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как техническая часть подготовки должна быть выполнена с высокой точностью. Для сбора клеток CHO-ICAM обработайте культуру 0,5% раствором трипсина ЭДТА в течение одной минуты при комнатной температуре, аккуратно встряхивая пробирку.

Когда клетки начнут открепляться, нейтрализуйте трипсин четырьмя миллилитрами свежей среды и подсчитайте количество диссоциированных клеток. Разведите клетки до концентрации 0,75 × 10⁵ клеток на камеру и осадите их в центрифуге. Затем ресуспендируйте осадок в полной культуральной среде CHO-ICAM из расчета 30 µL на одну проточную камеру и медленно внесите аликвоты клеток объемом 30 µL в каждый резервуар проточной камеры.

Выдержите клетки в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2 в течение пяти минут. Затем добавьте по 200 µL полной питательной среды в оба резервуара каждой камеры и верните планшет в инкубатор для культивирования в течение ночи. После сбора Т-клеток подсчитайте их и разведите клеточную суспензию до концентрации 2 × 10⁶ клеток на камеру.

Затем центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадок в одном миллилитре PBS, дополненного 1% glucose на каждые 2 × 10⁶ Т-клеток. Далее проведите маркировку Т-клеток с использованием CFSE в разведении от 1 до 1000 в защищенном от света месте в течение восьми минут при комнатной температуре. По окончании инкубации центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадок в 240 µL бессывороточной среды RPMI на одну камеру.

Затем распределите клетки по трубкам объемом 1.5 мл (по одной трубке на каждую камеру) и храните их в нагревательном блоке при 37 °C до начала загрузки. Перед началом визуализации прогрейте камеру микроскопа для живой съемки до 37 °C и наполните стеклянную бутыль объемом 500 мл водой. Проделайте в крышке два отверстия с пометками «вход» (in) и «выход» (out), затем пропустите шланг, соединяющий шприц, через отверстие «вход», а шланг, соединяющий резервуар для подачи, — через отверстие «выход».

Используйте шприц объемом 60 мл, чтобы промыть входной шланг 60 мл воды, а затем 60 мл бессывороточной среды при 37 °C, чтобы удалить воздух из системы. После подготовки шланга перенесите всю входную установку в камеру для прижизненной визуализации микроскопа для поддержания температуры системы на уровне 37 °C. Выведите шланг и шприц за пределы камеры и установите шприц в шприцевой насос.

Затем сделайте отверстие в крышке бутылки объемом 250 milliliter, которая будет служить контейнером для отходов, и проденьте выходную трубку через это отверстие в бутылку. После этого неплотно закройте крышку бутылки с отходами и поместите всю систему сбора отходов в камеру для живой визуализации. Теперь установите предметное стекло с проточной камерой на предметный столик микроскопа и с помощью объектива 20X настройте фокальную плоскость на монослое CHO ICAM.

Затем, начиная с нестимулированного контроля, удалите три объема по 70 µL из выходного резервуара первой камеры и добавьте три объема по 70 µL Т-клеток, меченных CFSE, в входной резервуар. Пока Т-клетки перемещаются от входа к выходу, снимите изображения пяти случайных полей CFSE-положительных Т-клеток в каждой камере для получения исходного подсчета клеток перед началом потока. Далее одновременно подсоедините входной и выходной шланги к резервуарам проточной камеры, стараясь не допустить попадания пузырьков воздуха, и начните подачу потока с напряжением сдвига при скорости 0,3 mL/мин, продолжая визуализацию окрашенных CFSE Т-клеток.

Как только будет замечено движение T-клеток, запустите таймер на пять минут; прекратите поток по истечении этого времени. Затем сделайте снимки пяти полей зрения с CFSE-положительными клетками в каждой камере, выбирая поля случайным образом для получения подсчета клеток после потока. Для стимуляции PMA подвергните одну пробирку с T-клетками воздействию PMA в качестве положительного контроля непосредственно перед загрузкой T-клеток во вторую проточную камеру для визуализации, как было продемонстрировано выше.

Для стимуляции SDF-1 alpha сначала удалите три аликвоты среды по 70 µL из выходного резервуара третьей камеры, затем добавьте 70 µL SDF-1 alpha во входной резервуар. Через пять минут удалите три аликвоты по 70 µL из выходного резервуара и добавьте оставшуюся пробирку с T-клетками для визуализации, как было продемонстрировано выше. На этих репрезентативных изображениях до начала потока при различных условиях стимуляции наблюдается примерно одинаковое количество T-клеток.

После пяти минут непрерывного напряжения сдвига количество адгезивных Т-клеток увеличивается в условиях стимуляции PMA и SDF-1 alpha, в то время как лишь несколько нестимулированных Т-клеток остаются прикрепленными. В частности, активация Т-клеток с помощью SDF-1 alpha вызывает почти двукратное увеличение адгезии Т-клеток по сравнению с нестимулированными контрольными клетками. Кроме того, при расчете процента адгезии первичных CD3-положительных Т-клеток человека в присутствии или отсутствие SDF-1 alpha выяснилось, что в условиях напряжения сдвига адгезируют 15% нестимулированных Т-клеток по сравнению с 50% Т-клеток в условиях активации SDF-1 alpha.

После освоения данную методику можно вполне успешно расширить до шести экспериментальных камер в одном анализе. При выполнении этой процедуры важно помнить, что следует работать только с конфлюэнтным монослоем ICAM. После завершения данной процедуры на полученных изображениях можно провести другие исследования, например, анализ формы клеток, для поиска ответов на дополнительные вопросы.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как количественно оценить адгезию клеток в условиях напряжения сдвига. Благодарим за просмотр этого видео, и желаем удачи в ваших экспериментах.