Выделение и расширения мезенхимальных стволовых / стромальные клетки, полученные из плаценты человека ткани

Общая цель данной процедуры заключается в выделении и экспансии мезенхимальных стволовых стромальных клеток, полученных из тканей плаценты человека. Здравствуйте, я Майк Доран, руководитель группы в Квинслендском технологическом университете при Институте трансляционных исследований в Брисбене, Австралия.

Здравствуйте, меня зовут Ребекка Пелеканос, я исследователь в Центре клинических исследований Университета Квинсленда. Сегодня я продемонстрирую процедуру выделения МСК. Обычно плацента утилизируется после родов.

Поскольку масса ткани составляет от 5 до 700 граммов, она представляет собой уникально большой источник аллогенных мезенхимальных стволовых клеток. Как правило, исследователи, которые только начинают заниматься выделением МСК из плаценты, сталкиваются с трудностями из-за незнания анатомии плаценты, особенностей обработки ткани, а также того, какие именно клетки — материнские или фетальные — будут составлять итоговую культуру МСК. Чтобы помочь исследователям, в данном видео мы подробно обсуждаем эти важные аспекты.

Первым этапом данной процедуры является ознакомление с анатомией плаценты. На втором этапе с помощью ножниц необходимо вручную выделить 10 граммов ткани из любой из следующих зон: децидуальной оболочки, ворсин хориона или хориональной пластинки. Первые два этапа еще раз схематично представлены здесь.

На третьем этапе ткани децидуальной оболочки, ворсины хориона или пластинки хориона дополнительно измельчают ножницами до получения мелких фрагментов. На четвертом этапе клетки высвобождают из мелких фрагментов ткани путем переваривания в течение одного-двух часов с использованием диспазы и коллагеназы I. На пятом этапе клетки отделяют от волокнистой ткани, промывая их через клеточный фильтр. Затем клетки собирают, ресуспендируют в культуральной среде и переносят в культуральные колбы.

Мезенхимальные стромальные клетки, MSCs, будут отобраны на основании их способности прикрепляться к пластику, а также способности выживать и пролиферировать в среде для культивирования клеток. Наконец, в разделе результатов экспандированные MSC могут быть охарактеризованы и сохранены для использования в будущих экспериментах. Плацента представляет собой временный орган, обеспечивающий обмен питательными веществами и продуктами жизнедеятельности между плодом и матерью во время беременности.

Плаценту можно легко собрать асептически после кесарева сечения и безопасного рождения ребенка. Плацента состоит преимущественно из сосудистой сети и перепонок плода. Однако она также содержит некоторые материнские клетки.

Плацента соединена с маткой как через материнские децидуальные клетки матки, так и через инвазивные трофобласты плода. Обычно невозможно визуально определить точную границу раздела между материнскими и фетальными тканями. Однако фетальная сторона плаценты легко идентифицируется по расположению пуповины.

После рождения ребенка с плацентой остается соединена лишь тонкая прослойка децидуальной ткани. Благодаря анатомическому расположению плаценты можно определить местонахождение трех типов тканей, которые мы будем собирать сегодня. Первой будет собрана материнская децидуа.

Зеленый маркер указывает на децидуальную ткань, которая остается на поверхности после отделения плаценты от стенки матки. Вторым типом ткани, который будет выделен из внутренней части плаценты, являются ворсины хориона плода. Это отмечено синими кругами на диаграммах.

Третьей тканью для забора будет фетальная хорионная пластинка. Эта ткань отмечена красными маркерами на диаграммах. Итак, приступим.

Поместите плаценту в бокс биологической безопасности. Раскройте плодные оболочки и определите расположение частей плаценты: плодную сторону с местом прикрепления пуповины, хорионамниотическую оболочку или амниотический мешок.

На плодной поверхности плаценты в хориальной пластинке отчетливо видны крупные кровеносные сосуды, покрытые амниотической мембраной, которая также легко отделяется механически. Материнская сторона находится напротив плодной и характеризуется наличием выраженных котиледонов или долек. Убедитесь, что материнская поверхность обращена вверх.

Отрежьте фрагменты толщиной 0.5 cm от материнской стороны плаценты или децидуальной оболочки. Во время препарирования помещайте фрагменты ткани в чашку Петри с сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS), чтобы ткани оставались влажными. Встряхните ткани в чашках с HBSS, чтобы удалить излишки крови.

Перенесите достаточное количество ткани, чтобы заполнить пробирку объемом 50 мл до отметки 10 мл, что составляет примерно 10 г. Примечание: на данном этапе можно выделить больше ткани, если в конце процедуры потребуется большее количество клеток. Убедитесь, что плодная поверхность обращена вверх.

Механически удалите амниотическую оболочку с плодовой поверхности плаценты, оставив хориальную пластинку нетронутой. Разрежьте хориальную пластинку на полоски, погружаясь примерно на полсантиметра в ткань ворсин под ней. Затем проведите диссекцию ткани хориальных ворсин на глубину примерно один сантиметр в плаценту в тех местах, где хориальная пластинка была удалена.

Поместите ткани в HBSS и отмерьте примерно 10 миллилитров ткани, как это было сделано ранее. Перенесите фрагменты ткани с минимальным количеством жидкости в чашку Петри диаметром 10 сантиметров и измельчите их ножницами на мелкие кусочки объемом примерно один кубический миллилитр. Перенесите измельченную ткань обратно в пробирку объемом 50 мл.

Повторите процедуру для всех остальных образцов ткани. Добавьте свежеприготовленную среду для переваривания в соотношении не менее одного к одному к объему ткани. Несколько раз переверните пробирку для перемешивания.

Инкубируйте ткани в пробирке с digest-средой в течение одного-двух часов при 37 °C в качающемся инкубаторе. Когда раствор для переваривания тканей станет мутным и в растворе станут заметны белые кровеносные сосуды, добавьте 15 мл HBSS, чтобы разбавить ферменты в digest-среде. Кратковременно центрифугируйте образцы в режиме импульсного центрифугирования до достижения 340 ×g в течение пяти секунд, после чего остановите центрифугу.

Это приведет к тому, что крупные частицы оседут на дно пробирки. Верните образцы в шкаф биологической безопасности. Поместите клеточный фильтр в новую пробирку объемом 50 мл.

Перенесите пипеткой супернатант, содержащий мононуклеарные клетки, в сетку-фильтр, собирая элюат в новую пробирку. Осадок из фрагментов плацентарной ткани оставьте в первой пробирке. Добавьте 15 milliliters HBSS к остаткам плацентарной ткани, тщательно перемешайте для извлечения дополнительных клеток и центрифугируйте образец коротким импульсом.

Снова перенесите супернатант пипеткой в пробирку с клеточным фильтром, помещенным в пробирку для сбора. В зависимости от консистенции образца может быть удобнее просто налить супернатант на клеточный фильтр. Промойте клеточный фильтр 5 миллилитрами HBSS.

Утилизируйте пробирку с остатками плацентарной ткани. Центрифугируйте образец супернатанта в течение пяти минут при 340 g для осаждения клеток. Эритроциты видны в виде слоя на дне осадка, а мононуклеарные клетки, включая MSCs, представляют собой более светлый слой над эритроцитами.

Верните образцы в шкаф биологической безопасности. Осторожно слейте супернатант и утилизируйте его. Несколько раз слегка постучите по пробирке пальцем, чтобы отделить клеточный осадок, и ресуспендируйте осадок в 35 миллилитрах среды для MSC.

Перенесите клеточную суспензию в один флакон T175 на каждые 10 млн клеток ткани и культивируйте в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2. После изоляции замените культуральную среду через 48 часов. Подкармливайте культуры раз в неделю до достижения конфлюэнтности.

Культуры должны стать конфлюэнтными примерно через 14 дней. Наконец, проведите экспансию и криоконсервацию клеток, проанализируйте характеристики MSC и используйте их в экспериментах. После 48 часов культивирования MSC прикрепятся к пластику для культур тканей, в то время как гемопоэтические и другие популяции клеток останутся неприкрепленными.

В этот момент среду заменяют 35 миллилитрами свежей культуральной среды. Внешний вид супернатанта культуры может существенно различаться в зависимости от донора плаценты. Эта вариативность продемонстрирована в примерах один и два.

Эти два выделения проводились одновременно, но из двух разных плацент. После промывки культуры очищаются от эритроцитов и остатков тканей, как показано в примере три, и последующие результаты экспансии обычно идентичны. После замены среды через 48 часов к колбе прикреплено лишь несколько клеток.

Через семь дней после изоляции становятся видны фибробластические колонии МСК, хотя присутствуют и неМСК-клетки, имеющие округлую форму или слабо прикрепленные к поверхности. Через 13 дней после изоляции фибробластические колонии МСК становятся крупными, и зачастую монослой МСК достигает достаточного уровня конфлюэнтности для проведения пассирования. Начиная с первого пассирования и далее, монослой МСК при достижении конфлюэнтности приобретает характерную морфологию в виде «вихрей».

МСК плаценты демонстрируют классический профиль маркеров МСК при анализе методом проточной цитометрии. Клетки положительны по CD73, CD105 и CD90 и отрицательны по гемопоэтическим маркерам CD45, CD34 и HLA-DR. МСК плаценты обычно подвергаются выраженной остеогенной дифференцировке, но характеризуются слабой адипогенной дифференцировкой.

Во многих публикациях утверждается, что клетки, выделенные из плодного хориона, при культивировании дают плодowe МСК. Однако, как мы сообщали ранее, все культуры, полученные из плодного хориона по данному протоколу, быстро обогащаются материнскими МСК, что ожидаемо для культур МСК из материнской децидуальной оболочки. Представленные здесь данные количественно определяют состав плодковых и материнских клеток в культурах МСК плаценты, выделенных из децидуальной оболочки, ворсин хориона и пластинки хориона.

После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как выделять и культивировать МСК, полученные из плацентарной ткани. Надеемся, что эти методы окажутся полезными в ваших исследованиях и клинических применениях, в которых могут использоваться МСК плацентарного происхождения.