Выделение и расширения мезенхимальных стволовых / стромальные клетки, полученные из плаценты человека ткани

Общей целью этой процедуры является выделение и расширение мезенхимальных стволовых стромальных клеток, полученных из ткани плаценты человека. Привет, меня зовут Майк Доран. Я являюсь руководителем группы в Квинслендском технологическом университете в Институте трансляционных исследований в Брисбене, Австралия.

Здравствуйте, меня зовут Ребекка Пелеканос, я научный сотрудник Центра клинических исследований Университета Квинсленда. Сегодня я покажу процедуру изоляции MSC. Плацента обычно отбрасывается после рождения.

Поскольку ткань весит от 5 до 700 граммов, она представляет собой уникально большой источник аллогенных мезенхимальных стволовых клеток. Как правило, люди, которые плохо знакомы с выделением плацентарного МСК, испытывают трудности, потому что они не знакомы с анатомией плаценты и не знают, как обрабатывать ткань, а также не знают, какой тип клеток, материнских или фетальных, будет заполнять их окончательную культуру МСК. Чтобы помочь исследователям, мы обсудим эти важные детали в этом видео.

Первым шагом в этой процедуре является ориентация на анатомию плаценты. Вторым шагом в этой процедуре является ручное рассечение 10 граммов ткани либо с децидуа, либо с ворсин хориона, либо с пластины хориона с помощью ножниц. Первые два шага снова схематически обобщены здесь.

На третьем этапе децидуа, ворсинки хориона или ткани пластины хориона дополнительно измельчаются на мелкие кусочки ножницами. На четвертом этапе клетки освобождаются от мелких кусочков ткани путем одного-двухчасового разложения в диспазе и коллагеназе, I.In пятом этапе клетки отделяются от волокнистой ткани путем промывания их через клеточное сетчатое фильтр. Затем клетки собирают, ресуспендируют в питательной среде и помещают в колбы для культур.

Мезенхимальные стромальные клетки, МСК, будут отбираться на основе их склонности к пластической адгезии и способности выживать и размножаться в среде клеточной культуры. Наконец, в разделе результатов расширенная МСК может быть охарактеризована и сохранена для использования в будущих экспериментах. Плацента является временным органом, который позволяет обмениваться питательными веществами и продуктами жизнедеятельности между плодом и матерью во время беременности.

Плацента может быть легко собрана асептически после кесарева сечения и безопасного рождения ребенка. Плацента преимущественно состоит из сосудистой сети и оболочек плода. Тем не менее, он также содержит некоторые материнские клетки.

Плацента соединена с маткой как материнскими децидуальными клетками маточного происхождения, так и трофобластами, происходящими от плода, вторгающимися. Обычно на глаз невозможно различить точную границу между тканями матери и плода. Тем не менее, фетальная сторона плаценты легко идентифицируется как сторона, где находится пуповина.

Когда ребенок рождается, к плаценте остается только тонкий слой децидуальной ткани. С помощью физической ориентации плаценты можно определить, какие три ткани мы собираем сегодня. Первой тканью будет заготавливаться материнская децидуа.

Зеленый маркер указывает на децидуальную ткань, которая остается на поверхности после отхождения плаценты от стенки матки. Вторая ткань, которая будет собрана из внутренней части плаценты, — это ворсины хориона плода. На это указывают синие кружки на схемах.

Третьей тканью, которую нужно собрать, будет фетальная хорионическая пластина. Эта ткань обозначена красными маркерами на диаграммах. Итак, приступим.

Поместите плаценту в шкаф биологической безопасности. Раскройте плодные оболочки и сориентируйтесь по частям плаценты. Плодная сторона с прикреплением пуповины, хориоамниотическая лапа или амниотический мешок.

Плодная поверхность плаценты имеет явные крупные кровеносные сосуды в хорионической пластинке, с перекрывающей ее околоплодной оболочкой, которая, опять же, легко отделяется механически. Материнская сторона противоположна стороне плода, с явными семядолями или лопастями. Убедитесь, что материнская поверхность обращена вверх.

Отрежьте кусочки толщиной 0,5 см с материнской стороны плаценты или децидуа. Во время вскрытия поместите кусочки ткани в чашку Петри, содержащую сбалансированный раствор соли Хэнка, или HBSS, чтобы ткани оставались влажными. Взбалтывайте ткани в посуде с помощью HBSS, чтобы удалить немного крови.

Переложите достаточное количество ткани для заполнения тюбика до отметки 10 миллилитров 50-миллилитровой трубки, примерно 10 граммов. Обратите внимание, что на этом этапе можно выделить больше ткани, если в конце процедуры требуется больше клеток. Убедитесь, что поверхность плода обращена вверх.

Механически удалить околоплодную оболочку с плодной поверхности плаценты, оставив хорионическую пластину нетронутой. Разрежьте пластину хориона на полоски примерно на полсантиметра вглубь ворсинчатой ткани под ней. Затем рассеките ворсиническую ткань хориона примерно на один сантиметр вглубь плаценты, откуда была удалена пластинка хориона.

Поместите салфетки в HBSS и отмерьте примерно 10 миллилитров ткани, как это делалось ранее. Переложите кусочки салфетки с минимальным переносом жидкости в чашку Петри диаметром 10 сантиметров и нарежьте ножницами на мелкие кусочки примерно один кубический миллилитров. Переложите измельченную салфетку обратно в трубку 50 мил.

Повторите эти действия для всех остальных образцов ткани. Добавьте свежеприготовленную среду для переваривания в соотношении не менее одного к одному с тканью. Переверните трубку несколько раз для перемешивания.

Инкубируйте ткани в пробирке с перевариваемой средой в течение одного-двух часов, при температуре 37 градусов в встряхивающем инкубаторе. Когда тканевый раствор для переваривания изменился на мутный вид, а белые кровяные сосуды стали очевидны в растворе, добавьте 15 миллилитров HBSS для разведения ферментов в перевариваемой среде. Кратковременно импульсно центрифугируйте образцы только до тех пор, пока центрифуга не достигнет 340 g в течение пяти секунд, а затем остановитесь.

Это заставит крупный мусор собираться на дне трубки. Верните образцы в шкаф биологической безопасности. Поместите клеточный фильтр в новую 50-миллилитровую пробирку.

Пипеткой введите надосадочную жидкость, содержащую мононуклеарные клетки, в сетчатый фильтр, улавливая элюат в новой пробирке. Оставьте остатки плацентарной ткани в первой пробирке. Добавьте 15 миллилитров HBSS к плацентарному мусору, энергично встряхните, чтобы восстановить больше клеток, и импульсируйте образец центрифугированием.

Снова пипетируйте надосадочную жидкость в пробирку с клеточным фильтром в пробирке для сбора. Заливка надосадочной жидкости в сетчатое фильтр клетки может быть более целесообразной, в зависимости от консистенции образца. Промойте сетчатое фильтр ячейки 5 миллилитрами HBSS.

Выбросьте трубку, содержащую остатки плацентарной ткани. Центрифугируйте образец надосадочной жидкости в течение пяти минут при 340 г для гранулирования клеток. Красные кровяные тельца видны в виде слоя в нижней части гранулы, а мононуклеарные клетки, включая МСК, представляют собой более легкий слой поверх красных кровяных телец.

Верните образцы в шкаф биологической безопасности. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость и выбросьте. Прокрутите трубку несколько раз пальцем, чтобы выбить клеточную гранулу, и снова суспендируйте клеточную гранулу в 35 миллилитрах среды MSC.

Перенесите клеточную суспензию в одну колбу T175 на 10 мил ткани и культивируйте в инкубаторе с температурой 37 градусов с 5% CO2. После изоляции смените питательную среду через 48 часов. Подкармливают культуры один раз в неделю до слияния.

Культуры должны слиться примерно к 14 дням. Наконец, расширить и криоконсервировать клетки, проанализировать характеристики МСК и использовать в экспериментах. После 48 часов культивирования МСК прикрепляется к тканевой культуре пластики, в то время как гемопоэтические и другие клеточные популяции этого не делают.

В это время среду заменяют на 35 миллилитров свежей питательной среды. Внешний вид супернатанта культуры может существенно различаться у разных доноров плаценты. Первый и второй примеры демонстрируют эту вариацию.

Эти два выделения были выполнены одновременно, но из двух разных плацент. После промывки культуры очищаются от эритроцитов и остатков тканей, как показано в примере 3, и последующие результаты экспансии в целом согласуются. После 48-часовой смены среды к колбе прикрепляется только несколько ячеек.

Через 13 дней после выделения колонии фибробластических МСК имеют большие размеры, и часто монослой МСК достаточно сливается и готов к прохождению. От прохода к дальнейшим этапам монослой MSC приобретает характерную вихревую морфологию при слиянии.

Плацентарные МСК отображают классический маркерный профиль МСК с помощью анализа проточной цитометрии. Клетки положительны на CD73, CD105 и CD90 и отрицательны на гемопоэтические маркеры CD45, CD34 и HLA-DR. Плацентарные МСК обычно подвергаются устойчивой остеогенной дифференцировке, но слабой адипогенной дифференцировке.

Во многих публикациях предполагается, что клетки, выделенные из хориона плода, дают МСК плода после культивирования. Однако, как мы сообщали ранее, все культуры, полученные из хориона плода с использованием этого протокола, быстро обогащаются для материнских МСК, как и следовало ожидать для материнских децидуальных культур МСК. Представленные здесь данные количественно оценивают фетальный и материнский клеточный состав культур плацентарных МСК, выделенных из децидуальных, ворсинических ворсин хориона и тканей пластин хориона.

После просмотра этого видео у вас должно быть довольно хорошее представление о том, как изолировать и культивировать МСК, полученный из плацентарной ткани. Мы надеемся, что вы найдете эти методы полезными в своих исследованиях и клинических приложениях, в которых могут использоваться МСК, полученные из плаценты.