Анализ мозга Митохондрии Использование последовательного Block-Face сканирующая электронная микроскопия

Общая цель метода последовательной сканирующей электронной микроскопии состоит в том, чтобы проанализировать морфологию, структуру, распределение, объем и количество митохондрий в определенной области мозга мыши. Этот метод может помочь ответить на многие ключевые вопросы нейробиологии, например, влияют ли изменения в структуре, количестве и распределении митохондрий мозга на нейродегенеративные расстройства и нарушения развития нервной системы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он автоматизирует процесс визуализации серийных срезов за счет использования специального ультрамикротома, встроенного в камеру сканирующего электронного микроскопа в низковакуумном режиме.

Чтобы начать эксперимент, промойте предварительно подготовленные глутаральдегид-фиксированные ткани три раза по пять минут каждая в 0,1 молярном какодилатном буфере. После фиксации тканей 1 миллилитром какодилата буферизированной 0,1% дубильной кислоты в течение 30 минут при комнатной температуре. После фиксации промойте ткани в какодилатном буфере.

Растворите 0,3 грамма ферроцианида калия и 0,86 грамма какодилата натрия в 10 миллилитрах дистиллированной воды. Непосредственно перед применением добавьте 10 миллилитров 4%-ного тетраоксида осмия и окрасьте ткани 2%-ным раствором ферроцианида осмия на 90 минут на льду. После окрашивания промойте ткань в дистиллированной воде.

Обработать образцы свежеприготовленным 1%-ным раствором тиокарбогидразида или раствором ТСН в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем промойте образцы. Далее окрашивайте ткани 2%-ным водным тетраоксидом осмия в течение одного часа.

После окрашивания промойте ткани дистиллированной водой. Инкубируйте образцы в течение ночи в 1%-ном уранилацетате в дистиллированной воде при температуре 4 градуса Цельсия. На следующий день промойте салфетки в дистиллированной воде и инкубируйте их с аспартатом свинца Велтона в духовке.

Получение наилучших возможных оттенков окрашивания тканей имеет решающее значение для визуализации, так как плохое окрашивание приводит к появлению на образце явления заряда, что затрудняет или делает невозможным получение изображений. Промойте салфетку в дистиллированной воде. Обезвоживайте образцы с помощью градуированной серии спирта с использованием охлажденных растворов этанола в течение пяти минут каждый, после чего следует 100% этаноловая дегидратация три раза по 10 минут каждый.

Промойте образцы два раза по 15 минут каждый в оксиде пропилена. Поместите салфетки в смесь смолы и оксида пропилена в соотношении 1:1, закройте флакон крышкой и инкубируйте ткани на ночь. Откройте флакон через два часа, чтобы оксид пропилена испарился в течение девяти часов.

Переложите салфетки в 100% свежую закладную смолу в чистые флаконы на два часа. Поместите образцы в свежую закладную смолу в плоские формы, содержащие напечатанные бумажные этикетки, и отверждите их в духовке. Через час проверьте расположение и выравнивание тканей и при необходимости отрегулируйте.

Обрежьте образцы в интересующей области и закрепите их на алюминиевом штифте с помощью гелеобразующего цианоакрилатного суперклея. Затем покройте образец коллоидной серебряной пастой по бокам блока, чтобы обеспечить проводящий путь к алюминиевому штифту. Исследуйте образцы тканей с помощью сканирующего электронного микроскопа, оснащенного внутрикамерным ультрамикротомным столиком и детектором низкокиловольтных обратно рассеянных электронов.

Представьте образцы с этими настройками. Начните анализ, выбрав «Изображение», «Тип», затем «8-бит», чтобы преобразовать изображения в 8-битный формат TIFF из исходного проприетарного 16-битного формата. Если автоматическое преобразование контрастности и/или яркости на этом шаге не является идеальным для изображений, повторно откройте 16-битные изображения и нажмите Изображение, Настройка, Яркость/Контрастность.

Выберите диапазон, который подходит для всех изображений, и нажмите Применить. Затем выполните преобразование. Если произошло недопустимое перемещение изображения между срезами, выровняйте стеки изображений, выбрав «Плагины», «Регистрация» и «Линейное выравнивание стека» с помощью SIFT, и установите выравнивание для режима только перевода, а не для жесткого тела.

Увеличьте размер холста перед регистрацией, выбрав Изображение, Настройка, Размер холста. В качестве альтернативы можно уменьшить изображение до области интереса, выбрав нужную область и затем обрезав ее. При необходимости масштабируйте изображения до меньшего и более удобного размера с помощью ImageJ, а затем выберите «Изображение и масштабирование».

Конфокальная микроскопия культур нейронов низкой плотности показала, что митохондрии, находящиеся в сомах нейронов, образуют ретикулярную сеть, в то время как митохондрии, находящиеся в дистальных нейритах, демонстрируют дискретную удлиненную морфологию. С помощью последовательной сканирующей электронной микроскопии с блок-лицом, или SBFSEM, митохондрии, дендриты и варикозное расширение аксонов были четко наблюдаемы в мозге мыши. Трехдневная реконструкция митохондрий в нейритах мозговой ткани мыши показала разницу в размерах между дендритными и аксональными митохондриями.

Данные, извлеченные из репрезентативного двухмерного изображения SBFSEM, показали, что объем или размер митохондрий, находящихся в нейрональных пресинапсах, был значительно меньше, чем тех, которые находились во внесинаптической области. Изображения, полученные с помощью анализа SBFSEM, обеспечивают повышенное разрешение для визуального отображения ультраструктурных характеристик отдельных митохондрий. Можно классифицировать клеточный компартмент митохондрий, определив его близость к легко идентифицируемым структурам, таким как несинаптические соматические митохондрии и пресинаптические митохондрии.

Этот метод может быть выполнен примерно за семь дней, что включает в себя три дня окрашивания, два дня на отверждение смолы, один день визуализации для получения стека, подходящего для этого анализа, и от двух до четырех часов на постобработку изображений при подготовке к анализу. Эта процедура также может быть использована в сочетании с другими методами визуализации митохондрий, такими как живая визуализация генетически меченых митохондрий, чтобы ответить на вопросы о митохондриальном транспорте и динамике их деления и слияния.