Наблюдение за митотического деления и динамика в живом данио Эмбрион

Общая цель данной процедуры заключается в мониторинге точности сегрегации хромосом во время митоза в живом эмбрионе данио-рерио с использованием флуоресцентно меченных хроматина и белков клеточных мембран, которые фиксируются с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области изучения митоза, например, каким образом дефекты митоза приводят к нарушениям развития или образованию опухолей в живом организме позвоночного? Основным преимуществом данной методики является наблюдение за митозом в живом организме позвоночного, что позволяет собирать физиологически значимые данные.

После скрещивания взрослых особей zebrafish и инъекции икры РНК H2A. F/Z-EGFP и/или pCS2 mCherry-CAAX, примерно за два часа до визуализации, используйте флуоресцентный диссекционный микроскоп для идентификации GFP-положительных эмбрионов. Перенесите ярко-зеленые, экспрессирующие GFP эмбрионы в новую чашку Петри размером 100 на 15 миллиметров со средой E3 blue.

Прокипятите стоковый раствор 1% низкоплавкого агарозы в среде E3 blue. Перенесите три миллилитра расплавленной агарозы в культуральную пробирку размером 17 x 100 миллиметров. Поддерживайте агарозу в теплом состоянии, поместив пробирку в водяную баню при температуре 42 °C до начала использования.

Подготовьте 15-миллимолярный раствор трикаина, отобранные эмбрионы, низкоплавкий агарозу, среду E3 blue, чашку для культивирования диаметром 35 мм с покровным стеклом на дне и диссекционный световой микроскоп. Затем с помощью пинцета номер пять осторожно удалите хорионы с трех эмбрионов и поместите эмбрионы в отдельный контейнер для анестезии. После этого с помощью переносной пипетки добавьте три капли 15-миллимолярного трикаина в чашку, содержащую эмбрионы и 5 мл среды.

Добавьте три-четыре капли 15-миллимолярного раствора трикаина в пробирку с 1% расплавленным агарозой. После достаточного обезболивания эмбрионов перенесите их в чашку с покровным стеклом на дне, используя дозатор Pipetman P200, у которого отсечен один сантиметр наконечника. Удалите излишки раствора E3 blue с трикаином.

Медленно добавьте от 5 до 10 µL раствора низкоплавящего агарозы с трикаином поверх эмбрионов, нанося каждую каплю отдельно, чтобы предотвратить сближение эмбрионов. Затем, используя иглу калибра 21 длиной 1,5 дюйма, осторожно переместите эмбрионы в агарозе в нужное положение; если используется инвертированный микроскоп, расположите интересующую область как можно ближе к покровному стеклу. Из-за возможного смещения может потребоваться повторно проверить положение каждого эмбриона, чтобы убедиться, что они остаются в требуемом положении.

Возможно, эту процедуру придется повторить несколько раз до достижения идеального положения по мере затвердевания агара. Через несколько минут, чтобы проверить, застыл ли гель, используйте иглу, чтобы отделить небольшой кусочек агарозы. Когда его можно будет отделить от капли, используйте дополнительную низкоплавящую агарозу, чтобы сформировать купол над внедренными эмбрионами, закрывая всю покровное стекло.

Пока агароза затвердевает, приготовьте три миллилитра среды E3 blue с пятью каплями 15-миллимолярного трикаина, который будет использоваться для покрытия иммобилизованных эмбрионов во время визуализации. Для проведения 5D-конфокальной визуализации живых эмбрионов данио-рерио откройте программное обеспечение для визуализации и установите на микроскопе объектив 60X с числовой апертурой 1.4. Нанесите иммерсионное масло на объектив и поместите чашку для культивирования в держатель для предметных стекол на предметном столике микроскопа.

С помощью контроллера осей центрируйте интересующий эмбрион над объективом, затем поднимите объектив до соприкосновения с чашкой для культивирования. Залейте эмбрионы, закрепленные в агаре, раствором E3 blue и трикаином. Далее нажмите на иконку окуляра, чтобы рассмотреть эмбрионы через окуляр.

Отключите выбор Eye Port, затем перейдите в View, Acquisition Controls, A1 Scan Area, чтобы открыть инструмент A1 Scan Area. Выберите канал GFP, перезапустите сканирование и сфокусируйтесь на интересующей области вблизи покровного стекла. Остановите сканирование, выберите каналы GFP и mCherry и установите параметр усреднения линий (line-averaging) на normal.

Теперь выберите «View» (Вид), «Acquisition Controls» (Управление сбором данных), «ND Acquisition» (Сбор данных в ND), чтобы открыть инструмент A1 ND Acquisition. Начните сканирование. Затем, используя контроллер осей, расположите эмбрионы таким образом, чтобы область сканирования была заполнена максимально возможной частью тела zebrafish.

Установите верхний предел Z-стека так, чтобы клетки вышли из фокуса, оставив дополнительный запас пространства в 3 µm над образцом для обеспечения роста и перемещения клеток. Затем установите нижний предел на уровне, при котором клетки перестают быть видимыми, и задайте размер шага Z-интервала 2 µm. Для экспериментов, продемонстрированных в данном видео, настройте мощность лазера для визуализации, уровень HV или усиления (gain), а также уровни смещения (offset) в соответствии с приведенным ниже списком.

После установки параметров прекратите сканирование, чтобы избежать излишнего воздействия лазера, которое может привести к фототоксичности и фотообесцвечиванию образца. Теперь выберите значок усреднения по 2 линиям (2X line averaging), что обеспечит наилучшее качество изображения при максимально коротком времени сканирования. Выберите соответствующий временной интервал и продолжительность времени, необходимые для эксперимента.

Для делений клеток дикого типа интервалы съемки каждые две минуты в течение двух часов являются достаточными для определения продолжительности митоза. Деления, при которых контрольная точка сборки веретена активирована более тридцати минут, более подходящи для интервалов в четыре-пять минут в течение четырех часов, чтобы сохранить флуоресценцию, как показано здесь. Чтобы автоматически сохранять файл в процессе получения данных, установите флажок «Save to File» и присвойте файлу имя.

Наконец, дважды проверьте правильность всех установленных параметров и нажмите Run Now. После завершения сбора данных, чтобы просмотреть файл в трехмерном формате, нажмите на значок Volume Threshold. На этом изображении продемонстрирована возможность наблюдения за многочисленными делениями клеток при широком поле зрения хвоста эмбриона данио-рерио (zebrafish) дикого типа линии AB.

Деления клеток отмечены звездочками. Соответствующее видео показано здесь. В среднем наблюдалось 50 делящихся клеток в AB и 30 делящихся клеток в мутанте aurora B.

Чтобы учесть меньшее количество визуализированных митотических клеток в эмбрионе мутанта aurora B, было рассчитано соотношение митотических клеток к общему числу визуализированных клеток; это позволило предположить, что в эмбрионах мутантов aurora B количество клеток, проходящих митоз, не ниже, а просто меньше общее число визуализированных клеток. Для количественной оценки продолжительности митоза количество временных интервалов, необходимых для одного деления клетки, умножается на временной интервал между каждым Z-стеком. Как показано на этом графике, среднее время деления в диком типе AB составляет 25 минут, а у мутанта aurora B — 58 минут.

Как и в эмбрионах дикого типа, можно различить каждую фазу митоза. Однако в эмбрионе с мутацией aurora B наблюдаются дефекты митоза, включая остановку митоза и нарушение цитокинеза, что приводит к образованию двухядерной клетки и последующему формированию микроядер; это подтверждает увеличение времени деления, измеренное у данного мутанта. После освоения данной методики процедура — от скрининга эмбрионов до настройки параметров конфокального микроскопа — может быть выполнена за один час.

При выполнении данной процедуры важно учитывать контекст проводимого эксперимента, в частности, область интереса, общую продолжительность съемки, временной интервал и глубину по оси Z. Это поможет максимально повысить эффективность работы, а также предотвратить фотообесцвечивание и фототоксичность. После данной процедуры можно применить другие методы, например, анализ метафазных пластинок (chromosome spreads), чтобы получить ответы на дополнительные вопросы о причинах наблюдаемых митотических дефектов, или использовать воздействие лекарственных препаратов для определения их влияния на прогрессию, продолжительность митоза или судьбу клетки.

После своей разработки этот метод открыл исследователям в области биологии возможность изучать митоз в контексте биологии развития и рака, используя данио-рерио. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как иммобилизовать эмбрионы zebrafish, проводить живую визуализацию митоза, а также анализировать частоту и продолжительность митоза и судьбу клеток. Не забывайте, что работа с мощными лазерами и флуоресцентным светом может быть вредна для зрения, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как исключение прямого попадания лазерного луча в глаза.