Наблюдение за митотического деления и динамика в живом данио Эмбрион

Общая цель этой процедуры заключается в мониторинге точности сегрегации хромосом во время митоза у живого эмбриона данио-рерио с использованием флуоресцентно меченного хроматина и белков клеточных мембран, которые будут захвачены с помощью конфокальной микроскопии с высоким разрешением. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области митоза, например, как митотические дефекты приводят к дефекту развития или образованию опухоли в организме живого позвоночного? Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы наблюдаем митоз в живом организме позвоночных, что позволяет собирать психологически значимые данные.

После разведения взрослых рыбок данио и введения яиц с H2A. F/Z-EGFP и/или pCS2 mCherry-CAAX РНК, примерно за два часа до визуализации, используют флуоресцентный препарирующий микроскоп для идентификации GFP-положительных эмбрионов. Перенесите ярко-зеленые, экспрессирующие GFP эмбрионы в новую чашку Петри размером 100 на 15 миллиметров с синей средой E3.

Вскипятите стоковый раствор 1%-ной малоплавкой агарозы в синем цвете Е3. Аликвотируйте три миллилитра расплавленной агарозы в культуральную пробирку размером 17 на 100 миллиметров. Держите агарозу в тепле, поместив пробирку с культурой на водяную баню при температуре 42 градуса Цельсия до готовности к использованию.

Соберите 15-миллимолярный трикаин, отсеянные эмбрионы, низкорасплавленную агарозу, синий E3 и 35-миллиметровую стеклянную чашку для культуры с покровным дном, а также препарирующий световой микроскоп. Далее пинцетом номер пять аккуратно удалите хорионы из трех эмбрионов, и поместите эмбрионы в отдельную емкость для обезболивания. Затем с помощью переводной пипетки добавьте три капли 15-миллимолярного трикаина в чашку, содержащую эмбрионы, и пять миллилитров среды.

Добавьте три-четыре капли 15-миллимолярного раствора трикаина в пробирку 1%-ной расплавленной агарозы. Когда эмбрионы достаточно обезболиваются, с помощью P200 Pipetman, срезав один сантиметр кончика пипетки, перенесите обезболенные эмбрионы в чашку с покровным дном. Удалите излишки раствора синего трикаина E3.

Медленно добавьте от пяти до 10 микролитров раствора агароза-трикаина с низким содержанием таяния на эмбрионы, держа каждую каплю отдельно, чтобы гарантировать, что эмбрионы не сместятся близко друг к другу. Затем с помощью полуторной иглы 21-го калибра аккуратно ориентируйте эмбрионы в агарозе в нужное положение, ориентируя интересующую область как можно ближе к покровному листу, если использовать инвертированный микроскоп. Из-за смещения, которое может произойти, может потребоваться вернуться к каждому эмбриону, чтобы убедиться, что он остается в требуемом положении.

Возможно, это придется делать несколько раз, пока не будет достигнуто идеальное положение по мере затвердевания агара. Через несколько минут, чтобы проверить, схватился ли он, с помощью иглы разломите небольшой кусочек агарозы. Когда его удастся оторвать от капли, используйте дополнительную низкоплавкую агарозу, чтобы сформировать купол над внедренными эмбрионами, покрывая весь покровный лист.

Пока агароза затвердевает, приготовьте три миллилитра синей среды Е3 с пятью каплями 15-миллимолярного трикаина, которые будут помещены поверх внедренных эмбрионов во время визуализации. Чтобы выполнить 5D-конфокальную визуализацию живых эмбрионов рыбок данио-рерио, откройте программное обеспечение для визуализации и установите микроскоп на объектив с числовой апертурой 60X 1,4. Нанесите на линзу иммерсионное масло и поместите чашку для культуры в держатель предметного стекла на предметном столике микроскопа.

С помощью контроллера оси расположите интересующий эмбрион над линзой объектива и поднимите линзу так, чтобы она соответствовала чашке для культивирования. Залейте Е3 синим и раствором трикаина эмбрионы, внедренные в агар. Затем нажмите на значок Eye Port, чтобы просмотреть эмбрионы через окуляр.

Отключите выбор порта глаза и выберите «Вид», «Элементы управления сканированием», «Область сканирования A1», чтобы открыть инструмент «Область сканирования A1». Выберите канал GFP, перезапустите сканирование и сфокусируйтесь на интересующей области рядом с обложкой. Остановите сканирование, выберите каналы GFP и mCherry и установите параметр усреднения линий в нормальное положение.

Теперь выберите «Вид», «Элементы управления захватом», «Захват ND», чтобы открыть инструмент сбора данных A1 ND. Начните сканирование. Затем с помощью контроллера оси расположите эмбрионы так, чтобы область сканирования была заполнена как можно большим количеством рыбок данио.

Установите верхний предел Z-стека так, чтобы клетки находились вне фокуса, оставляя дополнительные три микрометра пространства над образцом для роста и движения клеток. Затем установите нижний предел, при котором ячейки больше не видны, и установите размер шага Z-интервала равным двум микрометрам. Для продемонстрированных здесь экспериментов отрегулируйте мощность лазера визуализации, HV или усиление и уровни смещения соответственно, как указано ниже.

После установки параметров отключите сканирование, чтобы предотвратить ненужное воздействие лазера, которое может вызвать фототоксичность и фотообесцвечивание образца. Теперь выберите значок усреднения строки 2X, который обеспечивает наилучшее качество изображения и самое быстрое время сканирования. Выберите подходящий интервал времени и продолжительность времени, необходимые для проведения эксперимента.

Для деления клеток дикого типа двухминутные временные интервалы продолжительностью в два часа являются достаточными для определения митотической продолжительности. Подразделения, которые активируют контрольную точку сборки шпинделя дольше тридцати минут, больше подходят для четырех-пятиминутных интервалов в течение четырех часов, чтобы сохранить флуоресценцию, как показано здесь. Чтобы автоматически сохранить файл в процессе получения, установите флажок «Сохранить в файл» и присвойте файлу имя.

Наконец, еще раз проверьте, что все параметры установлены правильно, и нажмите «Запустить сейчас». После завершения сбора, чтобы просмотреть файл в трехмерном формате, нажмите на значок «Порог объема». Этот рисунок демонстрирует способность наблюдать за многими делениями клеток, используя широкое поле зрения хвоста дикой рыбки данио-рерио.

Клеточные деления обозначены звездочками. Соответствующий ролик показан здесь. В среднем наблюдалось 50 делебельных клеток у AB и 30 делебельных клеток у мутанта aurora B.

Чтобы объяснить уменьшенное количество митотических клеток, визуализированных у мутантного эмбриона авроры В, было рассчитано отношение митотических клеток к количеству визуализированных клеток, что позволяет предположить, что в мутантных эмбрионах авроры В существует не меньшее количество клеток, проходящих через митоз, а, скорее, меньшее количество визуализируемых клеток. Чтобы количественно оценить продолжительность митоза, количество временных интервалов, которые занимают одно деление клетки, умножается на интервал времени между каждым Z-стеком. Как показано на этом графике, среднее время деления AB дикого типа составляет 25 минут, а для мутанта aurora B — 58 минут.

Как видно на примере эмбрионов дикого типа, можно различить каждую митотическую фазу. Тем не менее, в мутантном эмбрионе авроры B наблюдаются митотические дефекты, которые включают остановку митотического ядра и поданный цитокинез, что приводит к образованию двуядерной клетки, и последующему образованию микроядер, которые поддерживают увеличенное время деления, измеренное у этого мутанта. После освоения этой техники ее можно сделать за один час, от скрининга эмбрионов до настройки параметров конфокального микроскопа.

При выполнении этой процедуры важно помнить о контексте рассматриваемого эксперимента, поскольку он относится к интересующей области, длительности времени, временному интервалу и Z-глубине. Это поможет максимально повысить эффективность, а также предотвратить фотообесцвечивание и фототоксичность. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как распространение хромосом, чтобы ответить на дополнительные вопросы о причине наблюдаемых митотических дефектов, или использование медикаментозного лечения для определения влияния на митотическую прогрессию, продолжительность или судьбу клетки.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии к изучению митоза в контексте биологии развития и рака с использованием рыбок данио. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как встраивать эмбрионы рыбок данио, получать живые изображения митоза и анализировать частоту, продолжительность и судьбу клеток митоза. Не забывайте, что работа с мощными лазерами и флуоресцентным светом может быть вредной для глаз, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как избегание прямого зрительного контакта с лазерами.