Разделительные Mesangiogenic клетки-предшественники (ПДК) из костного мозга человека

Общая цель этой процедуры заключается в выделении мезангиогенных клеток-предшественников или МПК из костного мозга человека путем селективного культивирования. Мы проверяем их как мезогенный, так и ангиогенный потенциалы. Мезангиогенные клетки-предшественники идентифицируются в низком процентном соотношении с помощью клеточной культуры mesen-ki-ma-stro-mo, оптимизированной для клинического применения.

Когда FBS как бы заменить на человеческую сыворотку. Этот метод уникален тем, что позволяет очень последовательно выделять большое количество алли-пол-ифицированных NPC, пригодных для проращивания, ангиогенеза и генерации синхронизированных культур МСК. Мы обнаружили это, когда после расщепления культур MCS в сыворотке talgrum несколько клеток в форме жареного яйца остаются прикрепленными, но дифференцируются в MCs после лечения FPS.

Для выделения мононуклеарных клеток костного мозга человека или МНК начинают с разведения от пяти до 10 миллилитров свежего костного мозга до общего объема 50 миллилитров с DPBS и смешивают клеточный раствор методом инверсии. Далее поровну распределите 25 миллилитров клеток по двум новым 50 миллилитровым коническим пробиркам и добавьте в каждую пробирку по 25 миллилитров свежего DPBS для повторного перемешивания методом инверсии. Затем дайте клеткам отдохнуть при комнатной температуре, чтобы минеральные костные фрагменты и жир отделились от раствора.

Через 10 минут с помощью пастерной пипетки осторожно удалите плавающий жир и отфильтруйте клеточные суспензии через индивидуальные фильтры 70 микрон, не нарушая гранулы минеральных костных фрагментов. Для выделения МНК слоя 20-25 мл разведенного костного мозга сверху комнатной температуры 1,007 грамма на миллилитр градиентной среды в каждую из двух пробирок по 50 мл и разделить клетки методом центрифугирования. Затем с помощью стерильной пастерной пипетки соедините белесые кольца клеток на входных гранях в новую 50-миллилитровую пробирку.

Изолированные мононуклеарные клетки промыть свежей питательной средой в течение пяти минут при 400-кратном G и комнатной температуре. Затем повторно суспендируйте гранулу в 5-10 миллилитрах свежей питательной среды. Для выделения ПДК уравновесьте гидрофобные колбы Т75 с 15 миллилитрами свежей питательной среды при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Через 30 минут засейте от четырех до шести раз по 10-7 мононуклеарных клеток костного мозга человека в колбе для 48-часовой инкубации. На второй день выбросьте среду и неадгезивные клетки из колб и подкормите клетки 15 миллилитрами свежей питательной среды. Верните культуры в инкубатор на шесть-восемь дней.

По окончании инкубации промойте адгезивные клетки свежим DMEM. Затем инкубируйте клетки с двумя миллилитрами раствора протеи свободного животного происхождения в течение пяти-15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Когда клетки поднимутся со дна колбы, добавьте 10 миллилитров свежей питательной среды, чтобы остановить реакцию, и соберите клетки центрифугированием, повторно взвесив гранулу в одном-двух миллилитрах свежей питательной среды.

После подсчета с ПДК планшет дважды по 10 до 4 на квадратный сантиметр клеток в культуру ткани обрабатывают культуральными колбами Т75 и склеивают клетки на ночь в 15 миллилитров свежей питательной среды в инкубаторе для клеточных культур. На следующее утро замените культивируемую среду 200 микролитрами на квадратный сантиметр мизанколмульстромульской клетки или расширяющей среды MSC и культивируйте клетки еще от 7 до 10 дней. Когда культуры достигают субкультуры слияния со скоростью от трех до пяти умножить на десять до трех клеток на квадратный сантиметр до достижения нового слияния второго пассажа в МСК, затем проводят расщепление протеи для сбора клеток, как было показано ранее.

Пластина два раза по десять до четвертой клетки на квадратный сантиметр в культуре тканей обрабатывают шестилуночными планшетами и свежей расширяющей средой. После повторного выращивания культур до слияния отметьте две лунки как отсутствие дифференциации и освежите среду расширения. Отметьте две скважины как остеовзрывы и замените среду 200 микролитрами на квадратный сантиметр стандартной остеогенной среды, специально разработанной для дифференциации МСК.

Затем отметьте две скважины как участки adipo и замените среду на 200 микролитров на квадратный сантиметр стандартной adipo genic среды, специально предназначенной для дифференциации МСК. Верните клетки в инкубатор для клеточных культур на две-три недели, пока клетки не дифференцируются. Затем приступают к флуоресцентному детектированию внеклеточных отложений кальция и интро накоплению клеточных липидных капель.

Чтобы получить 3D-сфероиды, засейте большое количество 20 микролитров свежевыделенной суспензии ПДК на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри. Когда все капли будут помещены, осторожно накройте крышкой основание чашки Петри, содержащее DPBS, чтобы предотвратить испарение висячих капель, и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на ночь. На следующее утро добавьте 300 микролитров стандартных белков внеклеточного матрикса в каждую лунку 24-луночного планшета с температурой 4 градуса Цельсия и гелизируйте матричные белки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Добавьте 700 микролитров стандартной сосудистой среды для роста эндотелиальных клеток, богатой эндотелиальным фактором роста, к гелеобразным белкам ECM. После того как ПДК агрегируются в 3D-сфероиды, осторожно переверните крышку чашки Петри и с помощью стерильной пастеровской пипетки аккуратно соберите сфероиды. Окончательно высейте сфероиды в культуральные лунки и верните тарелку в инкубатор.

Морфологически ПДК характеризуются характерной формой жареной яйцы с толстой сердцевиной, окруженной плоской тонкой периферией, демонстрирующей множество филиподий. Также часто наблюдается полярное удлинение внешней границы клетки. Культивирование МПК в среде для расширения МСК приводит к быстрой, но частичной дифференцировке в пролиферирующие плоские и многоразветвленные клетки с остаточными недифференцированными МПК, которые все еще обнаруживаются.

После дальнейшего пассажа культуры приводят к образованию монослоя экспоненциально растущих МСК-подобных клеток. В этом процессе МПК реорганизуют свой F-актин в стрессовые волокна, в то время как экспрессия Нестина ограничивается несколькими редкими клетками. Анализ потоков свежевыделенных МПК показывает, что более 95% клеток экспрессируют CD31 и CD45, но не имеют ассоциированных антигенов CD90 и CD 73.

Эти новейшие антигены обладают высокой экспрессией только после полной дифференцировки в МСК. Подтверждая их некоммерческую природу при кормлении дифференцирующей средой в течение как минимум двух недель, эти клетки могут быть легко индуцированы в остеобласты, о чем свидетельствуют отложения кальция или адипозита, о чем свидетельствует накопление липидных капель. Подтверждение МСК природы предифференцированных клеточных культур.

Типирование МПК дополнительно подтверждено в анализе прорастающего ангиогенеза, при этом клетки демонстрируют способность проникать в мирианский гель белка внеклеточного матрикса из 3D-сфероидов после 24 часов стимуляции фактора роста эндотелия сосудов. Через неделю вторгшиеся клетки мигрируют на еще большее расстояние, способность к инвазии которая теряется во втором пассаже МСК после мезангенной дифференцировки. После освоения культуры МСК могут быть созданы за один час, если правильно решить эту задачу, обеспечивая от одного до двух миллионов МПК менее чем за неделю.

При попытке выполнить эту процедуру важно оценить производительность партий CR человека до того, как они будут использоваться в культуре. На данный момент наш протокол выделения ПДК является единственным для получения высоковоспроизводимой близкой к чистой культуре МК для дальнейшего последующего применения. После своего развития эта методика открыла путь для исследований в области клеточной терапии, чтобы изучить возможность применения МПК в регенерации скелетных тканей.