Методы эволюции Robust пентозы брожения дрожжей для биоконверсии лигноцеллюлозы к этанолу

Общая цель этой процедуры адаптивной эволюции заключается в получении устойчивых штаммов нативных дрожжей ксилозного брожения scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, которые могут быстрее ферментировать сахара гексозы и пентозы в недетоксифицированных гидролизатах до экономически восстанавливаемого этанола. Этот метод продвигает вперед индустрию от лигноцеллюлозы до этанола, обеспечивая дорожную карту для штаммов со сложными модификациями, позволяющую ферментировать сахара в гидролизатах, содержащих микробные ингибиторы. В данном случае основное преимущество целенаправленной эволюции заключается в том, что устойчивые штаммы формируются из нативных дрожжей, способных ферментировать ксилозу, что устраняет необходимость в разработке промышленных штаммов Saccharomyces.

Мы поняли, что какой-либо отдельный штамм дрожжей вряд ли будет устойчив к различным типам гидролизатов, таким как предварительно обработанный AFEX кукурузный стебель или предварительно обработанный разбавленной кислотой просо. Способность scheffersomyces stipitis проходить через половой репродуктивный цикл полезна для дальнейшего использования в настоящей работе, поскольку различные разработанные штаммы могут быть объединены в один, более устойчивый штамм путем скрещивания штаммов, обладающих этими различными признаками. Демонстрировать процедуру будут соавторы Стефани Томсон и Морин Ши-Андерш, которые являются биологическими техниками в моей лаборатории.

Перед началом этой процедуры обогащения приготовьте предварительную культуру штамма NRRL Y-7124 в колбе объемом 125 миллилитров и серию разведения фермента осахаренного аммиачного волокна с расширением предварительно обработанного гидролизата кукурузной кукурузы или AFEX CSH. Используйте повторяющуюся пипетку, чтобы заполнить микропланшет на 96 лунок 15 микролитрами на лунку и восемью лунками на разведение гидролизата. Внесите несколько микролитров предварительной культуры в лунку, чтобы обеспечить начальное поглощение на уровне 620 нанометров, или A620 больше или равно 0,1.

Поместите микропланшет в пластиковую коробку с влажным бумажным полотенцем для влажности и статически инкубируйте в течение 24–28 часов при температуре 25 градусов Цельсия. Затем с помощью микропланшетного спектрофотометра определите культуры, которые физически выросли до A620 выше 1,0 при наиболее концентрированном гидролизированном разбавлении. Сгруппируйте выявленные лунки в микрофуговую пробирку и распределите по заполненной пластине.

Перекачайте от одного до пяти микролитров из заливной тарелки в каждую лунку новой серии гидролизатного разбавления, чтобы получить начальный A620, превышающий или равный 0,1, и инкубируйте планшет, как раньше. Следите за ростом культур в микропланшете с помощью микропланшетного спектрофотометра. Регулярно подготавливайте запасы глицерина адаптационных культур.

Объедините четыре лунки с наибольшей концентрацией гидролизата, колонизированные в криофиле, и смешайте один к одному с 20% стерильным глицерином. Заморозьте ячейки при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Повторяйте эту процедуру обогащения до тех пор, пока рост 12%-ного глюкана AFEX CSH не станет заметным через 24 часа.

Чтобы начать эту процедуру, проделывайте выбранные запасы глицерина с адаптацией культур к дрожжевой солодовой пептон-декстрозе, или YM-агару. Затем, после роста, используйте полосы для инокуляции 50 микролитров 3% или 6% глюкана AFEX CSH в каждую из трех микропланшетных лунок. Инкубируйте микропланшет в течение 24 часов при температуре 25 градусов Цельсия.

Бассейн повторяет колонизированные скважины с самой высокой прочностью гидролиза с сильным ростом. И разбавляем пластину до YM или 6% глюкана AFEX CSH агара. Инкубируйте планшеты в инкубаторе с температурой 25 градусов Цельсия в течение 24–48 часов.

Выберите пять одиночных колоний с самой высокой разбавляющей пластины, показывающей рост, чтобы заморозить их в виде глицериновых исходных культур. Прикрепите каждую колонию к пластине YM и инкубируйте в течение 24 часов. С помощью стерильной петли перенесите развитую полосу клеток в небольшой объем 10% глицерина, смешанного для суспензии клеток, и распределите по двум-трем криофайлам для замораживания при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Для тестирования изолятов в простых культурах периодического цикла 6%-ного глюкана AFEX CSH перенесите клетки с 48-часовых планшетов, прорезанных из запасов глицерина, в буфер с pH 7 и фосфатом калия для приготовления клеточных суспензий. После измерения оптической плотности каждой суспензии ячейки отрегулируйте объем с помощью дополнительного буфера, чтобы достичь A620 из десяти. Используйте один микролитр каждой суспензии для инокуляции в каждую из четырех лунок по 50 микролитров 3%-ного гидролизата глюкана до исходного A620 0,2.

Инкубируйте микропланшет в течение 24 часов. Затем перенесите две 24-часовые микролунки для инокуляции 25 миллилитровых прекультур 6%-ного глюкана AFEX CSH при pH 5. Закройте колбы крышками из силиконовой губки и инкубируйте в течение 24 часов при температуре 25 градусов Цельсия и 150 об/мин.

Используйте прекультуры AFEX CSH с 6%-процентным содержанием глюкана для инокуляции аналогичных культур роста объемом 25 миллилитров в двух экземплярах до исходного A620 0,1. Инкубируйте ростовые культуры в течение 24 часов при температуре 25 градусов Цельсия и 150 оборотах в минуту. Для проверки диоксианного недостатка изолятов в периодических культурах оптимально определенной среды, или ODM, со смешанными сахарами, инокулируют прекультуры объемом 75 мл ODM с концентрацией 150 грамм на литр ксилозы в колбах объемом 125 миллилитров с силиконовыми губчатыми крышками.

Инкубировать в течение 24 часов при температуре 25 градусов Цельсия и 150 об/мин. Используйте прекультуры для инокуляции в A620 0,1 аналогичного дубликата 75 миллилитровых тестовых культур с ODM, содержащим 75 граммов на литр глюкозы и 75 граммов на литр ксилозы при pH 6,5. Встряхивайте колбы при температуре 25 градусов Цельсия и 150 об/мин.

За 24 часа до инокуляции непрерывной культуры приготовьте предварительную культуру репрезентативной толерантной к AFEX CSH колонии в ОДМ, не содержащем этанола, в колбе объемом 125 миллилитров. Используйте от 5 до 10 миллилитров толерантного изолята AFEX CSH для инокуляции 100 миллилитров ODM в колбу с рубашкой объемом 100 миллилитров, чтобы получить начальный A620 0,5. Поддерживайте объем хранения культуры на уровне 25 градусов Цельсия.

Перемешайте его со скоростью 200 об/мин и оснастите стерилизуемым pH-электродом, регулятором pH и циркуляционной водяной баней с регулируемой температурой. Изначально, поскольку рост клеток будет медленным из-за воздействия этанола, установите насос, приводимый в действие рН, таким образом, чтобы при ферментации культуры снижение рН до 5,4 насос подавал рН 6,3 ODM со 100 граммами на литр ксилозы и 50 граммами на литр этанола, чтобы остановить дальнейшее снижение рН. Поддерживайте объем на уровне 100 миллилитров с помощью насоса для сточных вод, непрерывно снимающего сливки с поверхности культуры.

Измеряйте объем собранных сточных вод и отбирайте пробы из непрерывных культур каждые 48–72 часа для анализа жизнеспособной концентрации клеток, продуктов и субстратов, как описано в рукописи. Регулярно сохраняйте запасы глицерина, изолируя колонии от жизнеспособных планшетов буферизованных разведенных образцов, образуя от 30 до 100 колоний, представляющих наиболее распространенные в то время в обогащении устойчивые колонии. Залейте пластины пятью миллилитрами 10% глицерина, чтобы можно было подготовить дубликаты криофайлов.

Если культуры могут стабильно расти с определенной скоростью более 0,01 в час на ксилозе в присутствии более 25 граммов на литр этанола, начинайте непрерывную подачу культур с низкой скоростью разбавления примерно 0,01 в час на 100 миллилитров выдержки. Со временем поднимите содержание этанола в корме в сторону 50 грамм на литр. Ультрафиолетовое облучение инокулянты для возобновления непрерывных культур является одним из вариантов ускорения скорости мутаций.

Захват продвинутых популяций в запасах глицерина. Перед выделением колоний одиночных клеток популяции запасов глицерина с улучшенной ферментацией ксилозы в присутствии этанола идентифицируют, как описано в текстовом протоколе. Используйте эти превосходные популяции для создания полос пластин.

Полосатые пластины используются для получения плотных буферных клеточных суспензий A620, равных пяти. Затем клеточные суспензии используются для инокуляции прекультур в 96 глубоких луночных планшетов. Инкубируйте в течение 48 часов при температуре 25 градусов Цельсия, 400 об/мин и орбите в один дюйм.

Затем обогащайте толерантные колонии, используя каждую прекультуру для инокулирования 16 одномиллилитровых реплицитных культур до исходного A620 0,5 в предварительно обработанном кислотом гидролизате просо, смешанном один к одному с ODM плюс 50 граммов на литр ксилозы, и достаточным количеством этанола для получения 20, 30 или 40 граммов на литр этанола. Инкубируйте в течение 48 часов при температуре 25 градусов Цельсия, 400 об/мин и орбите в один дюйм. Для каждого отдельного запаса глицерина собирайте урожай в лунках с самой высокой концентрацией этанола для роста и использования ксилозы.

Поместите каждую клеточную линию в YM-агар, чтобы получить преобладающие одиночные колонии для сохранения в глицерине. Выберите 10 колоний на каждую клеточную линию и насадите каждую на агаровую пластину YM для приготовления глицеринового материала. После адаптации на AFEX CSH сравнение характеристик ферментации в ODM между исходным штаммом и адаптированными популяциями показало, что адаптированные популяции используют ксилозу более эффективно для производства этанола быстрее и в больших количествах.

Была дополнительно разработана колония, устойчивая к гидролизату, для улучшения толерантности к этанолу путем непрерывного отбора культур на ODM, содержащем ксилозу и высокие уровни этанола. Все адаптированные популяции превзошли родительскую в способности индуцировать метаболизм ксилозы в присутствии 40 граммов на литр этанола. На этих графиках обобщены характеристики превосходно толерантных изолятов, оцененные с точки зрения скорости поглощения ксилозы и выхода этанола по отношению к исходному штамму для каждой формы PSGHL.

Лучшие штаммы, отобранные из первичного скрининга на богатом ксилозой PSGHL, впоследствии были проверены на трех полных гидролизатах, и относительный индекс эффективности, или RPI, был рассчитан для ферментации каждого изолята в каждом гидролизате. Далее были рассчитаны объединенные общие индексы производительности для каждого изолята. Пять изолятов, три, 14, 27, 28 и 33, имели общий ИРЦ выше 60, что сделало их наиболее устойчивыми ко всем вариациям гидролизатов и питательных веществ вместе взятых.

После просмотра этого видео вы должны знать, как бросить вызов дрожжам, ферментирующим ксилозу, таким как scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, в целенаправленном процессе эволюции, обогащать, выделять и оценивать более надежные производные, которые более эффективно ферментируют смешанные сахара в недетоксифицированных гидролизатах. После освоения этой техники ее можно использовать с ежедневными затратами времени, составляющими в среднем около часа в день. Значительные изменения в процессе эволюции могут быть задокументированы всего за четыре месяца.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно регулярно спасать прогрессирующее население, подготавливая запасы глицерина к замораживанию при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Это позволяет восстанавливать популяцию, проводить периодическую оценку, изолировать или перезапускать процесс эволюции. Чтобы справиться с различными мутациями, не забывайте регулярно проверять дрожжи в конкретных технологических условиях на целый ряд фенотипов.

Расчет общих безразмерных относительных индексов эффективности, или RPI, на основе кинетических параметров, позволяет оценить ранг штамма и устойчивость к изменениям условий ферментации, таких как тип гидролизата и добавки питательных веществ. Превосходные дрожжи, возникающие на каждой фазе процесса эволюции, являются кандидатами для секвенирования генома, чтобы характер улучшений, таких как толерантность к ингибиторам, был снижен, а диоксичное отставание можно было понять и использовать для разработки биокаталитических штаммов следующего поколения.