Генома Очистка экстрахромосомального кольцевой ДНК из эукариотических клеток

Полногеномная очистка внехромосомной кольцевой ДНК из эукариотических клеток. Здравствуйте, я Расмус. Здесь я представлю общую схему метода очистки кольцевой ДНК.

В первой части осуществляется культивирование и сбор клеток дрожжей. Затем циркулярная ДНК подвергается очистке и амплификации в три этапа. Первый этап включает колоночное разделение, в ходе которого циркулярные молекулы ДНК очищаются и обогащаются.

Затем следует обработка ДНК экзонуклеазой для расщепления всей оставшейся линейной ДНК и, наконец, амплификация кольцевых молекул ДНК с помощью полимеразы phi-29. В пятой части данного протокола кольцевые ДНК подвергаются секвенированию, а полученные риды картируются на референсный геном Saccharomyces cerevisiae. В конце этого видео мы продемонстрируем некоторые репрезентативные результаты.

Мы обсудим перспективы будущих исследований и преимущества использования данного метода. Часть первая, сбор клеток. Стартовую культуру выращивают при 30 °C с перемешиванием до максимальной плотности, которая составляет примерно 200 миллионов клеток на мл и достигается через 24–48 часов.

Выросшую культуру переносят в пробирку Falcon и осаждают центрифугированием в течение трех минут. Супернатант удаляют. Крупный осадок перемешивают на вортексе в буфере TE и повторно осаждают центрифугированием.

Часть вторая, колоночная очистка. На этом этапе мы используем коммерчески доступный набор для колоночной очистки, который позволяет получить высокоочищенные плазмиды из геномной ДНК бактерий. Перед использованием этого набора для работы с дрожжами необходимо разрушить клеточную стенку.

Для этого промытый осадок клеток ресуспендируют в буфере L-1 из набора. Суспензию клеток переносят в микроцентрифужную пробирку и добавляют стеклянные шарики в объеме, составляющем одну треть от общего объема. Образец перемешивают на вортексе на максимальной скорости в течение 10 минут, после чего шарики удаляют путем центрифугирования при 2 000 оборотов в минуту в течение 30 секунд.

Супернатант переносят в новую пробирку. В данном методе мы добавляем в супернатант сильно разбавленные плазмиды в трех различных соотношениях. Мы предлагаем включить сильно разбавленную плазмиду в цикл.

Это может служить внутренним справочным руководством. Данный метод можно использовать для контроля качества очистки и амплификации ДНК; кроме того, с помощью этих добавочных плазмид можно провести полуколичественную оценку содержания нециркулярных ДНК на клетку. Следует добавлять только сильно разведенные плазмиды, так как в противном случае они повлияют на разрешение последовательностей других циркулярных ДНК.

К суспензии клеток, содержащей добавленные плазмиды, добавляют раствор L-2 из набора и следуют протоколу производителя. После нанесения образца на колонку белки, липиды и хромосомная ДНК удаляются путем двукратной промывки колонки. В элюированной фракции происходит значительное обогащение внехромосомной кольцевой ДНК.

Часть третья, переваривание линейной ДНК. На этом этапе мы используем экзонуклеазу для переваривания оставшейся линейной ДНК. ATP-зависимая экзонуклеаза специфически воздействует на линейную двухцепочечную и одноцепочечную ДНК, не переваривая кольцевую ДНК.

Специфичность экзонуклеазы к линейной ДНК была подтверждена методом гель-электрофореза после 29 часов обработки ДНКазой. Результаты показывают, что геномная ДНК подвергается расщеплению, в то время как плазмидная ДНК остается неизменной, что отмечено красной стрелкой. Дрожжи содержат 16 хромосом длиной до 1 500 килобаз.

Для облегчения переваривания экзонуклеазой используется редкий режущий эндонуклеазный фермент, чтобы увеличить количество доступных концов ДНК. При использовании рестрикционного фермента NotI каждая хромосома расщепляется до семи раз, как показано на рисунке. Очищенную методом колоночной хроматографии ДНК обрабатывают NotI при 37 °C в термоблоке в течение ночи.

После тепловой инактивации NotI расщепленная ДНК обрабатывается экзонуклеазами при 37 градусах согласно протоколу производителя. После обработки экзонуклеазами ферменты подвергают тепловой инактивации при 70 градусах в течение 30 минут. Для полного переваривания всей линейной хромосомной ДНК с помощью дополнительного АТФ и экзонуклеазы может потребоваться несколько дней. Чтобы убедиться в полном переваривании всей линейной ДНК, образцы анализируют методами ПЦР или кПЦР, используя внутренний референсный ген, такой как ACTI.

Часть четыре, амплификация ДНК. На этом этапе мы проводим обогащение и амплификацию кольцевой ДНК с использованием полимеразы phi-29. Реакция протекает при 30 °C с использованием случайных гексамерных олигонуклеотидов и phi-29.

Полимераза обладает высокой точностью и proof-reading активностью, что обеспечивает несмещенную амплификацию ДНК. Каждая полимераза способна путем репликации по типу «катящегося кольца» синтезировать до 100 килобаз ДНК. Полимераза также характеризуется высокой процессивностью, амплифицируя ДНК с коэффициентом до 10⁹ раз.

Часть пять, секвенирование. В соответствии с протоколом для высокопроизводительной платформы секвенирования следующего поколения, ДНК подвергают соникации до получения фрагментов среднего размера 300 base pairs и секвенируют с получением односторонних прочтений длиной 141 nucleotide. Прочтения последовательностей картируют на референсный геном Saccharomyces cerevisiae с использованием бесплатной базы данных Galaxy.

Секвенированные данные загружаются в Galaxy, и чтение картируется с помощью программы выравнивания коротких чтений Bowtie2, которая позволяет картировать частичные чтения. Часть шестая: репрезентативные результаты. После секвенирования и картирования на референсный геном Saccharomyces cerevisiae чтения можно визуализировать в браузере генома в программном обеспечении Galaxy.

ДНК кольцевого происхождения можно, например, подсчитать по участкам, содержащим когерентные риды длиной более одного килобазы, как показано на экране. Примером такого участка на четвертой хромосоме, где когерентные риды охватывают более одного килобазы, является область с генами гексозных транспортеров шесть и семь. При применении этого метода к популяции дрожжевых клеток в данном локусе часто обнаруживаются картированные риды, а глубина покрытия чтением четко указывает на то, что кольцо ДНК образовалось между паралогами генов гексозных транспортеров.

Из-за высокой гомологии последовательностей генов транспортеров гексоз мы предполагаем, что нелегитимная гомологичная рекомбинация приводит к циклизации этой ДНК. В модели мутации циклической ДНК предполагается, что процесс репарации ДНК протекает с ошибками. Например, при возникновении двуцепочечного разрыва в повторяющемся элементе гомологичная последовательность на той же хроматиде может быть использована в качестве матрицы для репарации ДНК посредством гомологичной рекомбинации.

После резекции, инвазии цепи, синтеза ДНК и разрешения всех соединений может образоваться кольцевая ДНК, которая отделяется от генома, вызывая делецию ДНК в хромосоме. Эффекты обработки ДНК экзонуклеазами и полимеразой phi-29 можно визуализировать с помощью окрашивания пропидия йодидом. Контрольные образцы окрашенной геномной ДНК выглядят как на левом изображении, а плазмидная ДНК — как на правом.

После 29 часов обработки 400 нанограммами геномной ДНК экзонуклеазой большая часть ДНК расщепляется, что показано на левом изображении. Этот результат подтверждается электрофорезом в геле, представленным на изображении справа. После 72 часов обработки экзонуклеазой с последующим синтезом DA с помощью полимеразы phi-29 все еще можно идентифицировать миллионы копий ДНК.

Аналогично, после 29 часов обработки 400 нанограмм геномной ДНК и дополнительных 100 нанограмм плазмидной ДНК экзонуклеазой большая часть геномной ДНК подвергается расщеплению. Однако, как показано на изображении геля, плазмидная ДНК не расщепляется. После обработки образца, подвергнутого воздействию экзонуклеазы в течение 72 часов, полимеразой phi-29 большая часть амплифицированной ДНК представлена в виде окрашенных плазмид.

Сначала мы провели скрининг генов на наличие кольцевой ДНК и были очень удивлены, обнаружив несколько сотен различных типов образцов ДНК. Да, нас действительно удивило то, насколько распространены кольца ДНК в популяции дрожжей, и мы полагаем, что этот метод может быть использован во многих видах исследований. Очевидно, одним из таких направлений может стать изучение тканей человека.

Известно, что гены могут амплифицироваться на нециркулярных элементах, а также, разумеется, в дрожжах и даже в опухолевых клетках. Я полагаю, что в целом будет интересно изучить соматические клетки и исследовать, какие типы циркулярной ДНК там обнаруживаются и каким образом может происходить этот процесс циркуляризации. В стареющих клетках с возрастом накапливаются кольцевые структуры, и мы ожидаем обнаружить больше генов на циркулярной ДНК.

Кроме того, мы хотели бы изучить молекулярные механизмы циклизации ДНК, и наиболее очевидным подходом будет использование дрожжей, имеющих мутации, приводящие к дефектам гомологичной и негомологичной рекомбинации. При изучении этих мутантов мы ожидаем, что профиль циклизации ДНК будет различаться в зависимости от типа мутации, и надеемся, что исследования на дрожжах позволят нам гораздо больше узнать о процессе циклизации ДНК. По сравнению с другими методами, данный метод обладает гораздо более высокой чувствительностью; фактически, он позволяет обнаружить кольцевую ДНК примерно в одной из 10 000 клеток.

И, насколько мне известно из данных обстоятельно проведенных исследований, мутантные аллели обычно должны составлять от 1 до 10% популяции, прежде чем их можно будет обнаружить. Верно, и при использовании данного метода вам не требуется никаких предварительных знаний о сформированных кольцевых ДНК, в отличие от других методик, где кольцевые ДНК должны быть в некотором смысле связаны, после чего их можно легко обнаружить как амплификации с помощью секвенирования или окрашивания хромосом.

Да, полагаю, что основным преимуществом здесь является чувствительность, и я надеюсь, что с помощью этого метода мы сможем реализовать множество интересных задач.