Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы использовать рыбок данио для наблюдения за эффектом нефротоксинов, таких как гентамицин или цисплатин, для моделирования острого повреждения почек. Основное преимущество этого метода заключается в том, что модель рыбки данио позволяет в режиме реального времени визуализировать повреждение и регенерацию клеток после острого повреждения почек. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте инструмент для манипуляций с эмбрионами для позиционирования эмбрионов для микроинъекции, прикрепив наконечник для загрузки геля на конце пятидюймовой прямой иглы для препарирования и закрепив его лентой или суперклеем.

Затем приготовьте несколько тонких конических игл для микроинъекций, вытянув отполированные огнем боросиликатные стекла с нитью накаливания с помощью дозатора. Затем с помощью лезвия бритвы или тонкого края щипцов разрежьте кончики игл, чтобы получить острые угловые кончики для инъекций. Впоследствии поместите иглы на полоску пластилина в чашку Петри, чтобы защитить кончики игл

Чтобы сделать лоток для микроинъекций, приготовьте 1,5%-ную раствор агарозы Е3 в колбе Эрленмейера объемом 100 миллилитров, растворив агарозу с Е3 в микроволновой печи. Затем дайте смеси остыть при комнатной температуре в течение примерно десяти минут. Остывший раствор агарозы Е3 вылить в чашку Петри, чтобы получился фундамент глубиной примерно 0,5 сантиметра.

После того как он застынет, полейте вторым слоем раствор агарозы Е3. Затем вставьте предварительно изготовленный эмбрион в форму под углом, чтобы избежать пузырьков воздуха, и дайте агарозе застыть при комнатной температуре. После того, как весь лоток для микроинъекций схватится, поднимите предварительно изготовленный эмбрион, медленно и осторожно вылейте его, затем наполните чашку раствором E3 и храните при температуре четыре градуса Цельсия.

В этой процедуре установите брачные резервуары для данио-рерио, поместив разделители в камеры для спаривания и заполнив их системной водой. Затем поместите по одной рыбе с каждой стороны разделителя так, чтобы в каждой брачной камере содержалась одна самка и один самец, и накройте обе брачные камеры. На следующее утро снимите разделители, чтобы дать возможность нереститься.

Примерно через 30 минут проверьте наличие эмбрионов на дне аквариума. Затем верните рыб в аквариум и соберите их эмбрионы, пропустив воду из брачного аквариума через мелкое ситечко. Затем переверните ситечко над чашкой Петри и промойте его Е3, чтобы собрать эмбрионы.

Впоследствии инкубируйте эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия в течение ночи. Когда эмбрионы достигнут 24-26 сомитной стадии, сцедите большую часть среды Е3. Затем дехорионате их, добавив среду Е3, затем 100 микролитров 50 мг на миллилитр проназы в каждую чашку с эмбрионами, затем инкубируйте эмбрионы при температуре 28 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Через 15 минут наполните блюдо E3, а затем аккуратно перемешайте, чтобы выбить хорионы из эмбрионов. Затем сцедите проназу Е3 и ополосните посуду 25 миллилитрами свежего E3.To блокируйте развитие пигментации, замените Е3 на 25 миллилитров свежей Е3 ПТУ через 24 часа после оплодотворения. Для экспериментов, продолжающихся несколько дней, заменяйте раствор E3 PTU свежим фильтрующим материалом один раз в день, чтобы посуда оставалась чистой.

В день инъекции приготовьте нужный раствор нефротоксина с соответствующим контролем автомобиля. Сделайте вихрь или аккуратно перемешайте. После этого проверьте боковые стороны трубки и верхнюю часть водяного столба, чтобы убедиться, что лекарства растворены в растворе.

Загрузите обрезанную иглу для микроинъекций двумя-тремя микролитрами нефротоксина, продев тонкий гелевый наконечник в заднюю часть иглы, и подвесьте иглу вертикально с помощью куска ленты, чтобы раствор мог заполнить обрезанный кончик иглы под действием силы тяжести. Как только кончик иглы заполнится, закрепите заряженную иглу в микроманипуляторе. Проверьте объем микровпрыска, поместив каплю минерального масла на предметное стекло микрометра, и введите в масло, чтобы оценить размер капли.

Далее достаньте чашку с эмбрионами из инкубатора и обезболите их, добавив в чашку для эмбрионов пять миллилитров 0,2%-ного трикаина. Затем перенесите эмбрионы в форму для литья под давлением с помощью трансферной пипетки. Переместите каждый эмбрион в разные лунки формы, поместив голову в самую глубокую область лунки так, чтобы туловище упиралось в углубление, а хвост немного торчал наружу.

Теперь вставьте заполненную иглу в микроманипулятор и расположите кончик иглы рядом с эмбрионом. Аккуратно введите иглу в хвостовую вену для микроинъекции. Самым важным этапом процедуры является микроинъекция.

Чтобы обеспечить успех, иглу нужно надрезать под острым углом, аккуратно переместить ее в положение рядом с эмбрионом. Если инъекция прошла успешно, вы должны увидеть, как жидкость попадает в кровоток. Совместное введение нефротоксиканта с флуоресцентно конъюгированным декстрином позволит исследователю убедиться в успешности инъекции после процедуры.

После этого аккуратно извлеките иглу из эмбриона. Переложите эмбрион в чистую посуду и промойте для удаления трикаина свежим E3 PTU. Затем инкубируйте эмбрион до нужного момента времени для оценки морфологии, которая может быть задокументирована с помощью фотографии в монтажной среде из метилцеллюлозы.

Или процесс для экспериментального анализа по желанию. Обратите внимание, что восстановление эмбрионов следует оценивать каждые 12-24 часа после инъекции, чтобы определить процент людей с отеком, который обычно указывает на повреждение почек. Прозрачность эмбриона рыбки данио облегчает процедуру микроинъекции и может быть дополнительно улучшена за счет химической обработки PTU при 24 hpf, чтобы уменьшить развитие пигментации в течение типичного экспериментального периода времени.

Здесь образцам эмбрионов позволяли развиваться через стадию 72 HPF, затем им вводили либо имитацию, либо микроинъекции с помощью физиологического раствора, либо микроинъекции 2,5 миллиграмма гентамицина на миллилитр. Последующее наблюдение в реальном времени проводилось через один и два дня после инъекции с использованием транслюминесцентного освещения с помощью стереомикроскопа. По сравнению с эмбрионами, введенными под действием ложного или физраствора, только у людей, получавших инъекцию гентамицина, наблюдалось развитие отека.

В этом случае отек перикарда, предполагающий отмену нормальной функции почек, согласуется с ранее опубликованными наблюдениями. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как гибридизация целой горы С2, чтобы получить доступ к изменениям в экспрессии генов после воздействия нефротоксина.