Использование батареи химических и экотоксикологических методов для оценки эффективности процессов очистки сточных вод для удаления эстрогенной потенси

Общая цель серии испытаний, описанных здесь, включая аналитическую химию и методы in vitro и in vivo, заключается в определении эффективности новых и нестандартных технологий очистки сточных вод для удаления эстрогенных загрязнителей. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области экологической инженерии, например, при выборе наиболее эффективных процессов очистки сточных вод в движущейся эстрогенной потенции сточных вод. Основное преимущество этих методик, заключается в том, что они чувствительны к очень низким концентрациям активных соединений, что свидетельствует о лучших технологиях для защиты водных организмов.

Демонстрацию процедур будут проводить научный сотрудник д-р Крис Грин, аспирант Анджела Пинзон, научный сотрудник д-р Элис Бейнс и старший научный сотрудник Никола Бересфорд. Процесс SPE требует пристального внимания к чистоте и упорядоченности для предотвращения загрязнения пробы. Предварительно очистите все трубки, краны и фритты метанолом.

Перед запуском проб подсоедините передаточные трубопроводы к экстракционному коллектору и промойте всю систему деионизированной водой. Чтобы запустить образцы, сначала прикрепите одноразовые вкладыши клапанов, затем прикрепите картриджи с дивинилбензолом стирола SPE. Затем нанесите пипеткой по пять миллилитров этилацетата в каждый резервуар для кондиционирования картриджей.

На этом этапе убедитесь, что SPE герметично. Затем включите вакуумный насос на скорость потока 10 миллиметров в минуту. Прежде чем картриджи высохнут, загрузите пять миллилитров метанола, а затем пять миллилитров воды.

Очень важно, чтобы картриджи SPE не пересыхали. После того, как вода в основном пройдет, выключите насос и долейте воду в каждый резервуар картриджа. Затем соедините трубки из ПТФЭ 1/8 дюйма между резервуарами для картриджей и стеклянными бутылками для образцов.

Теперь переключите вакуум на скорость потока ниже 10 миллилитров в минуту и дайте всему образцу пройти через картридж. Далее тщательно просушите картриджи SPE, пока содержимое картриджа не изменит цвет. Используйте пылесос или газовую струю.

Теперь загрузите чистые, сухие стеклянные флаконы объемом 10 миллилитров в штатив и поместите штатив внутрь экстракционного коллектора. Убедитесь, что каждый вкладыш находится над флаконом. Загрузите в резервуары для проб два раза по четыре миллилитра, всего восемь миллилитров дихлорметана, включите вакуумный насос и пропустите жидкость через SPE в коллекционные флаконы.

Затем с помощью концентратора уменьшите объем во всех флаконах для сбора до одного миллилитра. Переложите каждый образец во флакон с автосамплером и дополнительно сконцентрируйте их до 100 микролитров с помощью оборудования для продувки азотом. Следующим этапом процесса является использование ГФХ для устранения макромолекулярных интерференций.

Во-первых, введите 95 микролитров экстракта ускользающего образца в ВЭЖХ, оснащенный ГПК. Сконцентрируйте экстракт GPC до 200 микролитров с помощью концентратора и устройства для продувки азотом, а затем заполните его до двух миллилитров гексаном. Далее подсоедините одноразовые вкладыши клапанов, аминофиолетовые картриджи и резервуары для картриджей к коллектору SPE, а через 10-миллилитровые стеклянные коллекционные флаконы.

Теперь загрузите по два миллилитра гексана в каждый картридж, чтобы кондиционировать их и сбросить растворитель. Затем загрузите экстракт образца GPC в резервуар и всасывайте его. Отложите сбор экстракта в сторону и установите флакон на место в решетке, чтобы собрать смывку.

Далее пропустите через картридж два миллилитра 30 процентов объемного этилацетата и гексана. Затем добавьте еще два миллилитра этилацетата и гексана, затем выбросьте сборы моющего раствора и верните флакон для сбора объемом 10 миллилитров на стеллаж. Теперь добавьте в резервуар два миллилитра этилацетата и ацетона 50 процентов объемного объема и запустите насос с низким расходом, ниже двух миллилитров в минуту.

После того как жидкость протянется, добавьте в резервуар еще два миллилитра 50-процентного этилацетата. Теперь с помощью концентратора уменьшите объем экстракта до одного миллилитра. Затем переложите образец в стеклянный флакон меньшего размера и используйте оборудование для продувки азотом для выпаривания экстракта до начального уровня Добавьте 100 микролитров метанола, хорошо перемешайте образец и переложите его в флакон автосамплера с вкладышем объемом 0,3 миллилитра.

Затем проведите LC-MS/MS анализ экстракта. За день до начала анализа подготовьте свежую питательную среду и привите ее в Tenax Dock используемого штамма HER. На следующий день подготовьтесь к анализу, сделав 100 микролитров последовательного бреда исследуемых химикатов или экстрактов сточных вод, а затем стандартную кривую E2 в этаноле.

Теперь переложите 10 микролитров аликвот в маркированный стерильный планшет на 96 лунок. Затем оставьте тарелку открытой для испарения этанола. Далее готовят 50 миллилитров питательной среды, с 0,5 миллилитрами раствора CPRG.

С помощью 24-часовой культуры дрожжей измерьте мутность на 620 нанометрах, чтобы оценить плотность клеток. Затем добавьте 40 миллионов дрожжевых клеток к 50 миллилитрам исследуемой среды. Переложите инокулированную среду для анализа в стерильную кормушку, а с помощью многоканальной пипетки переведите по 200 микролитров среды в каждую лунку пластины для анализа.

Установите на место крышку пробирной пластины, заклейте края скотчем и энергично встряхивайте пробную пластину в течение двух минут с помощью встряхивателя для пластин. Затем инкубируйте тарелку при температуре 32 градуса Цельсия в нагревательном шкафу с естественной вентиляцией. После трех дней инкубации снова повторите встряхивание, а затем дайте дрожжам отстояться около одного часа.

Наконец, измерьте количество поглотителей света по образцам на 540 и 620 нанометрах. Образцы воды из обычного плана очистки сточных вод для активации процесса обработки осадка, были проанализированы с помощью электроспрея с отрицательными ионами LCMS, этинилэстрадиол присутствовал в концентрации выше прогнозируемого уровня отсутствия эффекта. Используя передовые методы очистки воды, такие как гранулированный активированный уголь, или GAC, удалось значительно снизить уровень этинилэстрадиола.

Все экстракты сточных вод были проанализированы с помощью изотопно маркированного внутреннего стандарта, красного пика, чтобы обеспечить количественную оценку. Скрининговый анализ дрожжей на эстроген был явно чувствителен к стандартному эстрадиолу, но не реагировал на этанол, который, по сути, является холостым ходом. Клетки дрожжевого экрана явно реагировали на активные отходы ила, в то время как очищенные GAC сточные воды вызывали меньшую реакцию, они были еще более биологически активными, чем холостые.

При использовании этой новой технологии очистки сточных вод концентрация эстрадиола этанола, показанная синим цветом, и эстрогенная активность, показанная зеленым, были значительно снижены за счет комбинированной обработки перекисью водорода и TAML. Очистные сооружения являются основным источником загрязнения поверхностных вод эстрогенными веществами. Новые способы улучшения процессов очистки воды требуют глубокого тестирования эстрогенной активности.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о батарее химических и экотоксикологических тестов, необходимых для измерения эстрогенной активности в пробах воды. Чрезвычайно важно обеспечить сведение к минимуму загрязнения образцов и экстрактов при бережном обращении с образцами и экстрактами. Например, обычно используемые пластмассы содержат эстрогенные соединения, поэтому важно включать отрицательный контроль для проверки на химическое загрязнение и положительный контроль, чтобы убедиться, что метод экстракции сработал и что есть хорошее восстановление спайковых эстрогенов.