Использование батареи химических и экотоксикологических методов для оценки эффективности процессов очистки сточных вод для удаления эстрогенной потенси

Общая цель описанного здесь комплекса тестов, включающего методы аналитической химии, а также методы in vitro и in vivo, заключается в определении эффективности новых и перспективных технологий очистки сточных вод по удалению эстрогенных загрязнителей. Данные методы помогают ответить на ключевые вопросы в области экологического инжиниринга, например, при выборе наиболее эффективных процессов очистки сточных вод с учетом изменения эстрогенной активности стоков. Основным преимуществом этих методов является их чувствительность к очень низким концентрациям активных соединений, что позволяет выявить наиболее подходящие технологии для защиты водной флоры и фауны.

Процедуры будут продемонстрированы постдоком, доктором Крисом Грином, аспиранткой Анджелой Пинсон, научным сотрудником доктором Элис Бейнс и старшим лаборантом-исследователем Николой Бересфорд. Процесс ТФЭ требует строгого соблюдения чистоты и порядка для предотвращения контаминации образцов. Предварительно очистите все пробирки, краны и фритты метанолом.

Перед анализом образцов подсоедините линии переноса к экстракционному коллектору и промойте всю систему деионизированной водой. Для проведения анализа сначала установите одноразовые вкладыши клапана, затем установите картриджи для ТФЭ на основе стирол-дивинилбензола. Затем дозируйте пипеткой 5 mL этилацетата в каждый резервуар для кондиционирования картриджей.

На этом этапе убедитесь, что SPE герметично закрыта. Затем включите вакуумный насос, установив скорость потока 10 millimeters per minute. До того как картриджи высохнут, внесите 5 milliliters метанола, а затем 5 milliliters воды.

Очень важно не допускать высыхания картриджей для ТФЭ. После того как большая часть воды пройдет через картридж, выключите насос и долейте воду в резервуары каждого картриджа. Затем соедините резервуары картриджей со стеклянными флаконами для образцов трубками из ПТФЭ диаметром 1/8 дюйма.

Теперь переключите вакуум на скорость потока менее 10 ml/мин и пропустите весь образец через картридж. Затем тщательно высушите картриджи для SPE, пока содержимое картриджа не изменит цвет. Используйте вакуум или поток газа.

Теперь поместите чистые сухие стеклянные пробирки для сбора объемом 10 миллилитров в штатив и установите штатив в экстракционный манифольд. Убедитесь, что каждый лайнер находится над пробиркой. Заполните резервуары для образцов дихлорметаном в объеме два раза по 4 миллилитра (всего 8 миллилитров), включите вакуумный насос и пропустите жидкость через SPE в пробирки для сбора.

Затем с помощью концентратора уменьшите объем в всех пробирках для сбора до 1 мл. Перенесите каждый образец в виалу для автосамплера и дополнительно сконцентрируйте их до 100 µL, используя установку для выпаривания под током азота. Следующим этапом процесса является использование GPC для удаления макромолекулярных примесей.

Сначала введите 95 µL экстракта элюированного образца в систему ВЭЖХ, оснащенную GPC. С помощью концентратора и установки для продувки азотом сконцентрируйте экстракт GPC до объема 200 µL, а затем доведите объем до 2 мл гексаном. Затем установите одноразовые прокладки клапанов, картриджи с амино-пурпурным сорбентом и резервуары для картриджей в манифольд для ТФЭ, используя стеклянные пробирки для сбора объемом 10 мл.

Теперь внесите по два миллилитра гексана в каждый картридж для их кондиционирования, после чего слейте растворитель. Затем поместите экстракт образца GPC в резервуар и пропустите его через картридж. Отставьте пробирку с собранным экстрактом в сторону и установите в штатив новую пробирку для сбора промывочного раствора.

Затем пропустите через картридж 2 мл смеси этилацетата и гексана (30% по объему). Затем добавьте еще 2 мл этилацетата и гексана, после чего удалите collected промывочный раствор и верните пробирку для сбора объемом 10 мл в штатив. Теперь добавьте в резервуар 2 мл смеси этилацетата и ацетона (50% по объему) и запустите насос при низкой скорости потока, менее 2 мл/мин.

После того как жидкость пройдет через систему, добавьте в резервуар еще 2 мл 50% этилацетата. Затем с помощью концентратора уменьшите объем экстракта до 1 мл. Перенесите пробу в стеклянный флакон меньшего размера и с помощью оборудования для продувки азотом упарьте экстракт почти досуха. Добавьте 100 µL метанола, тщательно перемешайте пробу и перенесите ее во флакон для автосамплера с вкладышем объемом 0,3 мл.

Затем проведите анализ экстракта методом ЖХ-МС/МС. За день до начала анализа приготовьте свежую питательную среду и инокулируйте ее из тенаксового блока используемого штамма HER. На следующий день подготовьтесь к анализу, создав серийные разведения исследуемых химических веществ или экстрактов сточных вод по 100 µL, а затем приготовьте стандартную кривую E2 в этаноле.

Теперь перенесите аликвоты по 10 µL в промаркированный стерильный 96-луночный планшет. Затем оставьте планшет открытым для испарения этанола. Далее приготовьте 50 mL питательной среды, добавив 0,5 mL раствора CPRG.

В 24-часовой культуре дрожжей измерьте мутность при 620 нанометрах для оценки плотности клеток. Затем добавьте 40 миллионов дрожжевых клеток в 50 миллилитров assay medium. Перенесите инокулированную assay medium в стерильный кювет и с помощью многоканального дозатора перенесите по 200 микролитров среды в каждую лунку планшета для анализа.

Закройте крышку планшета для анализа, загерметизируйте края лентой и интенсивно встряхивайте планшет в течение двух минут на шейкере для планшетов. Затем инкубируйте планшет при 32 Celsius в нагревательном шкафу с естественной вентиляцией. После трех дней инкубации повторно встряхните планшет, а затем дайте дрожжам осесть в течение примерно одного часа.

Наконец, измерьте поглощение света образцами при 540 и 620 нанометрах. Образцы воды с обычных очистных сооружений, использующих процесс активации активного ила, были проанализированы с помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрии (LCMS) с электрораспылением в режиме отрицательных ионов; при этом этинилэстрадиол присутствовал в концентрации, превышающей прогнозируемый уровень отсутствия эффекта. С помощью современных методов очистки воды, таких как гранулированный активированный уголь (GAC), удалось существенно снизить уровни этинилэстрадиола.

Все экстракты сточных вод анализировали с использованием изотопно-меченого внутреннего стандарта (красный пик) для обеспечения количественного определения. Анализ с использованием дрожжевого скрининга на эстрогены продемонстрировал явную чувствительность к стандартному эстрадиолу, однако никакой реакции на этанол, который фактически служил холостым контролем, выявлено не было. Клетки дрожжевого скрининга проявили выраженный ответ на эффлюент процесса очистки активным илом, в то время как эффлюент после обработки GAC вызвал более слабый ответ, который, тем не менее, оставался более биологически активным, чем холостой контроль.

При использовании этой новой технологии очистки сточных вод совместная обработка перекисью водорода и TAML значительно снизила как концентрацию этанолэстрадиола (показана синим цветом), так и эстрогенную активность (показана зеленым цветом). Очистные сооружения являются основным источником загрязнения поверхностных вод эстрогенными веществами. Разработка новых методов очистки воды для улучшения качества этих стоков требует углубленного тестирования эстрогенной активности.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о комплексе химических и экотоксикологических тестов, необходимых для измерения эстрогенной активности в пробах воды. Крайне важно свести к минимуму загрязнение проб и экстрактов за счет их осторожного обращения. Например, широко используемые пластики содержат эстрогенные соединения, поэтому необходимо включать отрицательные контроли для проверки химического загрязнения и положительные контроли, чтобы убедиться в эффективности метода экстракции и высоком проценте извлечения добавленных эстрогенов.