Сочетая прижизненной флуоресцентной микроскопии (IVFM) с генетической модели для изучения динамики приживления кроветворных клеток костного мозга ниши

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации и измерении in vivo приживления трансплантированных клеток крови в ниши костного мозга реципиента. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет визуализировать клеточные процессы, такие как хоуминг, экспансия и локализация в различных нишах костного мозга донорских гемопоэтических клеток после трансплантации. Используемый в сочетании с инженерными животными моделями, этот подход может помочь в определении молекулярных путей, критически важных для регенерации гемопоэтических клеток.

В отличие от гистологии или других методов визуализации, прижизненная микроскопия позволяет фиксировать межклеточные взаимодействия у живого животного на клеточном уровне и в режиме реального времени. Мы решили использовать этот метод, чтобы определить, является ли микроокружение костного мозга исходным местом развития миелопролиферативного заболевания, вызванного потерей передачи сигналов Notch. Проблемы для людей, плохо знакомых с этой техникой, включают в себя минимизацию артефактов дыхания, оптимальное положение и стабилизацию головы и предотвращение насыщения изображения.

За один-два часа до трансплантации опрыскайте лизированную мышь EGFP 70% этанолом. Затем с помощью хирургических ножниц сделайте разрез на коже каждой ноги вокруг лодыжки, а хирургическими щипцами удалите кожу и шерсть вместе, чтобы обнажить чистую мышечную ткань. Удалите как можно больше мышц с ног.

Затем разрежьте кости в коленном и голеностопном суставах и с помощью марлевых губок удалите остатки мышечной ткани с бедренных и большеберцовых костей. Промойте очищенные кости в шестилуночной пластине, содержащей DMEM с добавлением 10% FBS. Затем переложите все четыре кости задних ног в 10 миллилитров холодной ЭДТА в PBS в ступку и раздавите кости пестиком.

Измельчите клетки костного мозга до получения одноклеточной суспензии и процедите суспензию через фильтр 70 микрон в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Промойте фильтр двумя-тремя миллилитрами PBS. Затем центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах свежего DMEM плюс 10% FBS.

Для введения центрифугируют клеточную суспензию, затем подсчитывают и регулируют концентрацию клеток в 1,5 раза по 10 до седьмой клетки на миллилитр в IMDM без сыворотки. Поместите клетки на лед. Через пять-шесть часов после второй дозы облучения введите три раза по 10-шестую клетки костного мозга в хвостовую вену каждого облучаемого животного-реципиента.

Добавьте подходящий временной момент после трансплантации. Поместите мышь-реципиента под наркозом на грелку с температурой 37 градусов Цельсия и подтвердите отсутствие реакции на защемление пальца ноги. Нанесите мазь на глаза животного и введите 100 микролитров соответствующего флуоресцентного маркера через хвостовую вену.

Далее с помощью небольших электрических машинок для стрижки удалите шерсть со спинной поверхности головы животного с последующим нанесением крема для депиляции. Через пять минут удалите крем марлевыми губками и смойте остатки раствора солевым раствором. Продезинфицируйте кожу головы ватным тампоном, смоченным на 70% этанолом.

Затем с помощью тонких щипцов и ножниц сделайте разрез кожи средней линии на коже головы диаметром от 10 до 20 миллиметров, чтобы обнажить нижележащую дорсальную поверхность черепа. Используя хирургический шелк 5-0, наложите два швов с каждой стороны разреза, создав лоскут, чтобы обнажить кальварию для визуализации. Нанесите каплю масла на обнаженный череп.

Когда мышь находится в положении лежа на спине, погрузите обнаженную кожу головы в стеклянную посуду с дном, наполненную маслом для микроскопа. Затем поместите животное на многофотонную сцену для визуализации с кальварией над объективом и накройте животное грелкой с температурой 37 градусов Цельсия. Важно, чтобы голова оставалась стабилизированной в правильном положении во время получения многофотонного изображения.

Используйте стереотаксическое устройство или закрепите мышь скотчем. Используя инвертированную конфокальную систему, модифицированную для многофотонной визуализации, настройте двухфотонный лазер на 830 нанометров. Затем откройте соответствующее программное обеспечение для получения изображений.

В меню настроек съемки убедитесь, что выбран режим однонаправленного сканирования, и установите скорость сканирования равной четырем микросекундам на пиксель, частоте кадров 512 на 512 пикселей и зуму 1,5. Выберите мощность 20X Вт в объективе 0,95. Откройте окно со списком красителей и выберите два фотона.

Затем выберите зеркало RDM690 в окне контроллера микроскопа. В окне светового пути и кубика выберите два поля лазерного блока, чтобы проверить, открыт ли двухфотонный лазерный затвор. Выберите лампу EPI и выберите куб фильтра B/G EPI.

Затем сосредоточьте объектив на образце, чтобы визуализировать сосудистый поток в нише костного мозга кальварии, используя бифуркацию центральной вены и коронарного шва в качестве ориентиров. В режиме без сканирования выберите три внешних детектора и визуализируйте образец со скоростью сканирования четыре микросекунды на пиксель без усреднения и с постоянной мощностью лазера и усилением детектора, чтобы использовать полный динамический диапазон детектора с минимальным насыщением. После сбора серии срезов по глубине ткани откройте соответствующее специальное программное обеспечение для количественного определения и визуализации изображений от 3 до 4D.

Интерактивно визуализируйте стеки Z с помощью соответствующего алгоритма 3D-рендеринга в соответствии с инструкциями производителя. Затем используйте модуль сегментации точечных объектов для сегментации ячеек GFP и примените арифметическую обработку стека, чтобы исключить ложноположительные ячейки GFP в зеленом и красном каналах. Наконец, используйте модуль поверхностной сегментации для реформирования сегментации сосудистой и костной поверхности, применяя алгоритмы расстояния натяжения X от пятна до поверхности для вычисления расстояний клеток до любой из дистальных поверхностей по мере необходимости.

Здесь стеки Z, собранные из каждой из шести стандартных областей костного мозга, были визуализированы в виде 3D-проекции максимальной интенсивности, 3D-проекции тени, включая костный компонент, и 3D-сегментированных изображений, что позволило количественно оценить клетки и измерить их расстояние от кости и сосудов. В этом эксперименте визуализация in vivo миелоидных клеток в микроокружении костного мозга с дефектом Notch показала, что лизированные GFP-клетки донора имеют одинаковую эффективность хоуминга у реципиентов дикого типа и нокаута через 24 часа после трансплантации, в то время как в более поздние моменты времени они демонстрируют различную приживляемость. Анализ динамики экспансии миелоидных предшественников показал, что адаптивно трансплантированные клетки костного мозга разрастались быстрее и в большем количестве у реципиентов нокаута через две недели после трансплантации.

Донорские клетки костного мозга у реципиентов дикого типа увеличились позже, но в два раза больше, чем донорские клетки и нокаутирующие реципиенты через четыре недели, в то время, когда донорские клетки в нокаутирующем костном мозге уменьшаются, потому что они быстро вступают в циркуляцию. И что к шести неделям различия в количестве донорских клеток в костном мозге и кальварии нивелируются. Кроме того, 3D-анализ сегментации нижней средней области кальварии нокаута и дикого типа через шесть недель после трансплантации костного мозга показывает, что лизированные клетки GFP локализованы на одинаковом расстоянии от кости у обоих типов животных-реципиентов, но интересно, что у нокаутированных мышей они находятся более далеко от сосудистой сети.

После освоения прижизненная визуализация костного мозга может быть завершена за один час и 30 минут на мыши, если она выполнена правильно. При использовании этого подхода важно помнить о выборке нескольких участков костного мозга кальвариума у каждой мыши и анализировать не менее трех мышей за эксперимент, чтобы выявить любые внутри- и межвыборочные вариации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как сочетать трансплантацию костного мозга и прижизненную визуализацию для определения кинетики приживления специфической субпопуляции крови к микроокружению костного мозга.