Простой проточной цитометрии метод измерения глюкозы и глюкозы Transporter выражение для моноцитов субпопуляциях в цельной крови
12 августа 2016 г.
Моноциты являются неотъемлемыми компонентами врожденной иммунной системы человека, которые при активации зависят от гликолитического метаболизма. Мы описываем протокол проточной цитометрии для измерения экспрессии транспортера глюкозы и поглощения глюкозы общими моноцитами и субпопуляциями моноцитов в свежей цельной крови.
Общая цель данной методики заключается в измерении поглощения глюкозы и активности её транспортера в различных субпопуляциях моноцитов. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как: какова роль метаболизма иммунных клеток в исходах заболеваний? Основными преимуществами данных методов являются их быстрота, простота выполнения, отсутствие необходимости в реактивных материалах и потребность лишь в небольшом объеме крови.
В течение одного часа после сбора образцов крови в пробирки с антикоагулянтом ACD-B (цитрат) поместите образцы в бокс биологической безопасности. Затем перенесите по 100 µL крови из каждого образца в отдельные полипропиленовые пробирки и обработайте клетки 2 mL 1X лизирующего раствора на льду, осторожно перемешивая содержимое пипетированием. Через 15 минут центрифугируйте клетки, после чего проведите еще два цикла центрифугирования в промывочном буфере.
После второго промывания с помощью пипетки осторожно удалите как можно больше супернатанта, а затем ресуспендируйте осадок в 100 µL промывочного буфера на льду. Для идентификации конкретных субпопуляций моноцитов окрасьте клетки соответствующими антителами из расчета 5 µL антител на 100 µL клеток; инкубируйте в течение 30 минут на льду в темноте. По окончании инкубации промойте образцы дважды промывочным раствором и зафиксируйте клетки, добавив 200 µL 0.5% формальдегида в PBS.
Затем в течение 24 часов проанализируйте клетки на проточном цитометре с возможностью детектирования четырех цветов. Для оценки поглощения глюкозы субпопуляциями моноцитов перенесите 90 µl крови из каждого образца в отдельные полипропиленовые пробирки и добавьте в кровь 10 µl соответствующего флуоресцентного аналога глюкозы. Осторожно встряхните пробирки для перемешивания и оберните образцы алюминиевой фольгой.
Затем выдержите клетки при 37 °C в течение 15–30 минут, после чего немедленно перенесите их на лед. Далее добавьте в пробирки 4 мл лизирующего раствора для FACS и центрифугируйте клетки. Затем проведите второе центрифугирование в промывочном буфере.
Слейте супернатант и окрасьте клетки соответствующими антителами в течение 30 минут при температуре 4 °C в темноте. Затем промойте образцы 4 мл ледяного промывочного буфера, ресуспендируйте осадки в 200–300 µl ледяного PBS и проанализируйте содержимое пробирок в течение 10 минут. Для проведения проточного цитометрического анализа сначала используйте неокрашенные и индивидуально окрашенные контрольные образцы для настройки компенсации.
Далее в соответствующем программном обеспечении для анализа единичных клеток откройте первый образец на графике прямого и бокового светорассеяния (forward by side scatter plot) и выделите гейтом моноциты, как показано на иллюстрации. Затем дважды щелкните по выделенной популяции моноцитов и выделите гейтом CD3-отрицательную популяцию. Теперь дважды щелкните по CD3-отрицательной популяции и установите по оси x отображение окрашивания на CD14, а по оси y — окрашивания на CD16.
Затем, чтобы измерить поглощение глюкозы или активность её транспортера в определенной субпопуляции моноцитов, постройте соответствующие гистограммы. Далее, при наличии определенных популяций клеток, используйте контрольные образцы FITC igG для установки гейта и определения общего процента CD14-положительных моноцитов в каждом образце. Здесь представлена исходная стратегия гейтирования для изоляции моноцитов по светорассеянию и исключения T-клеток путем гейтирования внутри CD3-отрицательной популяции.
Затем проводится гейтирование моноцитов по экспрессии CD14 отдельно или в сочетании с CD16 для идентификации общей популяции моноцитов или их субпопуляций. Могут наблюдаться отдельные популяции CD14-положительных моноцитов, экспрессирующих транспортер глюкозы Glut-1, наиболее заметно в циркулирующих лейкоцитах, полученных от ВИЧ-положительных лиц. CD14-положительные Glut-1-положительные клетки также могут наблюдаться в специфических подмножествах моноцитов у ВИЧ-отрицательных лиц, хотя эти популяции более выражены у ВИЧ-положительных пациентов.
Как и ожидалось, исходя из данных об экспрессии транспортеров глюкозы, аналог глюкозы 2-NBDG также поглощается клетками лиц с ВИЧ-положительным статусом в большем количестве. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе может занять полтора часа. При проведении этой процедуры важно ограничить воздействие света на все области образцов.
После поглощения аналога глюкозы клетки можно окрасить антителами к клеточным поверхностным маркерам для идентификации интересующих вас специфических популяций иммунных клеток. После разработки этот метод может быть использован для определения того, как ВИЧ влияет на метаболизм иммунных клеток, а также может быть применен другими исследователями в различных областях, таких как иммунология, вирусология и онкология. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как определять экспрессию транспортера глюкозы 1 и поглощение глюкозы в иммунных клетках.
Не забывайте, что при работе с инфекционными агентами следует соблюдать стандартные процедуры безопасности.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол проточной цитометрии для измерения экспрессии транспортеров глюкозы и поглощения глюкозы моноцитами, которые являются важнейшими компонентами врожденной иммунной системы. Этот метод позволяет анализировать субпопуляции моноцитов в свежей цельной крови, что дает представление о метаболизме иммунных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточный метаболизм
- Проточная цитометрия
Теоретические основы
- Моноциты играют жизненно важную роль в иммунном ответе человека.
- Гликолитический метаболизм необходим для активированных моноцитов.
- Понимание механизмов поглощения глюкозы может дать информацию об исходах заболеваний.
- Проточная цитометрия позволяет проводить детальный анализ иммунных клеток.
Цель исследования
- Измерение поглощения глюкозы в субпопуляциях моноцитов.
- Изучение роли метаболизма иммунных клеток при заболеваниях.
- Обеспечение быстрого и эффективного метода анализа.
Используемые методы
- Сбор образцов крови в пробирки с антикоагулянтом цитратом ACD-B.
- Обработка клеток лизирующим раствором на льду.
- Центрифугирование и промывка клеток для последующего анализа.
- Проточная цитометрия для измерения экспрессии транспортеров глюкозы.
Основные результаты
- Успешное измерение поглощения глюкозы в моноцитах.
- Выявление различий в экспрессии транспортеров глюкозы.
- Понимание метаболических путей в иммунных ответах.
- Демонстрация эффективности и простоты использования метода.
Выводы
- Данный метод предоставляет ценные данные о метаболизме моноцитов.
- Понимание механизмов поглощения глюкозы может помочь в исследовании заболеваний.
- Этот протокол может быть применен в различных иммунологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет проводить экспресс-оценку метаболического перепрограммирования моноцитов в цельной крови, что способствует валидации мишеней в исследованиях иммунометаболизма и воспалительных заболеваний. Путем количественного определения поглощения глюкозы и экспрессии транспортеров в различных подмножествах моноцитов метод обеспечивает механистическое снижение рисков для терапевтических гипотез, связывающих метаболизм иммунных клеток с исходами заболеваний. Данный рабочий процесс повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет возможности функциональной валидации гликолитических сдвигов в первичных клетках человека без манипуляций ex vivo.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы путем измерения функционального поглощения глюкозы в субпопуляциях моноцитов в условиях гомеостаза и при воспалении.
- Операционная ценность: Обеспечивает биологическую проверку рисков для мишеней, участвующих в иммунометаболических путях, с использованием первичных моноцитов человека, выделенных из цельной крови.
- Прогностическая ценность: Способствует приоритизации портфеля препаратов путем корреляции экспрессии транспортеров глюкозы (например, Glut-1) с патологическими состояниями, такими как ВИЧ-инфекция.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: Подготовка валидированных субпопуляций моноцитов для последующего скрининга путем установления базовых показателей поглощения глюкозы при норме и патологии.
- Количественные данные: Получение гистограмм поглощения 2-NBDG и экспрессии поверхностных маркеров методом проточной цитометрии для обеспечения стандартизированных и воспроизводимых измерений.
- Масштабируемость: Использование малых объемов крови и стандартного оборудования для проточной цитометрии, что позволяет адаптировать метод для высокопроизводительного анализа когорт доноров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает переход от фундаментальных открытий к доклинической валидации путем мониторинга гликолитических сдвигов в моноцитах в различных моделях заболеваний и при терапевтических вмешательствах.
- Согласование биомаркеров: способствует идентификации метаболических биомаркеров (например, CD14+/Glut-1+ моноцитов), связанных с тренированным иммунитетом и хроническим воспалением.
- Принятие решений с учетом рисков: позволяет определить критерии принятия решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем количественной оценки состояний метаболической активации, которые предсказывают функциональный иммунный ответ.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий от валидации мишени до доклинической оценки, обеспечивая возможность метаболического фенотипирования первичных иммунных клеток человека на ранних стадиях.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез об иммунометаболических механизмах путем изоляции и количественного определения поглощения глюкозы в определенных подмножествах моноцитов (классических, промежуточных, неклассических).
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые, готовые к анализу результаты гликолитической активности посредством поглощения флуоресцентного аналога глюкозы, стандартизированные по всем образцам.
- Аналитика: предоставляет количественные данные проточной цитометрии (процент поглощения, средняя интенсивность флуоресценции), что позволяет сравнивать метаболические состояния при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает результаты с доклинической работой путем отслеживания метаболических сдвигов в моноцитах, которые коррелируют с прогрессированием воспалительных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для иммунометаболического профилирования, применимую к различным типам лейкоцитов и контекстам заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в иммунометаболизме, связывая экспрессию транспортеров глюкозы с функциональным поглощением в первичных моноцитах человека.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет четко определенных протоколов окрашивания, гейтирования и анализа с использованием стандартного оборудования для проточной цитометрии.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки за счет ранней метаболической валидации мишеней, что снижает риск неудач на поздних стадиях в программах по иммунологии и вирусологии.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию соединений или биопрепаратов с учетом рисков, основываясь на их воздействии на гликолитический поток в моноцитах и иммунную активацию.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с компенсацией при многоцветной проточной цитометрии и стратегиями гейтирования субпопуляций моноцитов.
- Необходим доступ к 4-цветному проточному цитометру и шкафу биологической безопасности для обработки крови.
- Для многоцентровых исследований требуется стандартизация протоколов окрашивания и времени ишемии во всех центрах.
- Адаптация метода для других субпопуляций лейкоцитов требует валидации панелей маркеров и кинетики поглощения аналогов глюкозы.
- Ограничением является 24-часовой период стабильности фиксированных образцов и необходимость оперативной обработки после забора крови.
