Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

Общая цель этой процедуры заключается в культивировании эндотелиальных клеток пупочной вены человека и анализе динамики цитоскелета и миграции клеток с помощью визуализации живых клеток. Методы, описанные в этом видео, могут помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной, молекулярной и механобиологии. Например, этот протокол может быть использован для определения того, как форма и подвижность клеток модулируются за счет задействования различных ВКМ.

Визуальная демонстрация имеет решающее значение, поскольку этапы подготовки образцов сложны в выполнении. Они требуют точного и своевременного обращения с клетками на протяжении всего процесса. Хотя этот метод может дать представление о подвижности эндотелиальных клеток во время ангиогенеза, он также может быть применен к микроскопическим исследованиям практически любой адгезивной клеточной модельной системы.

С помощью щипцов возьмите покровный листок из банки для хранения 100% этанола и пропустите его через пламя горелки Бунзена для стерилизации. Затем поместите его в 35-миллиметровую чашку Петри. Подготовьте по одному покровному листу для каждого образца.

В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра добавьте 10 микролитров одного миллиграмм на миллилитр стокового раствора фибронектина и 990 микролитров PBS. Затем нанесите пипеткой по 250 микролитров раствора на каждую покровную крышку. Равномерно распределите раствор, чтобы покрыть поверхность.

Инкубируйте покровные стекла не менее трех часов при температуре 37 градусов Цельсия. Перед использованием каждый покровный лист трижды промыть двумя миллилитрами PBS. С помощью гемоцитометра определить количество культивируемых HUVEC и перенести объем, содержащий 100 000 клеток на покровное стекло для экспериментов без миграции или 500 000 клеток на покровное стекло для экспериментов по миграции, в микроцентрифужную пробирку.

Вращайте ячейки в 1,400 раз G в течение четырех минут, чтобы разбить их на гранулы. После спина, для каждого тестируемого условия, ресуспендируйте до одного миллиона клеток в 100 микролитрах буфера электропорации и объедините их с одним микрограммом кДНК. Перенесите ячейки в кювету для электропорации.

Трансфицируйте клетки и смесь ДНК с помощью программы, предназначенной для электропорации HUVEC. Затем спасите трансфицированные клетки, добавив 500 микролитров полной эндотелиальной базальной среды. Затем нанесите соответствующий объем клеток на покровные стекла, покрытые фибронектином.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-четырех часов, чтобы дать время для экспрессии конструкций кДНК. При подготовке к снимку возьмите две полоски двустороннего скотча размером 2,5 на 0,65 сантиметра и закрепите их горизонтально вдоль верхнего и нижнего края чистого предметного стекла. Обратите внимание, что важно оставить небольшое пространство между лентой и скользящей кромкой для герметизации камеры.

Установите покровное стекло ячейкой вниз так, чтобы два края покровного стекла опирались на ленту. С помощью щипцов слегка надавите, чтобы зафиксировать покровное стекло. С помощью микропипетки добавьте 40 микролитров среды для визуализации между покровным стеклом и предметным стеклом.

Убедитесь, что пространство между покровным стеклом и предметным стеклом полностью заполнено средой для визуализации. При необходимости промокните излишки среды бумажной салфеткой. Заклейте все края слайдов теплым VALAP.

Проверьте наличие утечек, осторожно надавливая на стеклянную защитную крышку. Поместите установленный и запечатанный покровный стекло на предметный столик для микроскопа, предварительно нагретый до 37 градусов Цельсия. С помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском можно получить последовательности покадровых изображений, изображения синих флуоресцентных белков и изображения DIC.

Проанализируйте динамику микротрубочек и колокализацию, как описано в сопроводительном документе. Чтобы провести анализ миграции клеток, после этапа электропорации необходимо спасти трансфицированные клетки, добавив 80 микролитров полной эндотелиальной базальной среды. Затем нанесите пипеткой весь образец объемом 80 микролитров в виде одной капли на центр высушенного покровного стекла, покрытого фибронектином.

Не размазывайте каплю. Сушка покровного стекла необходима для предотвращения отделения капли объемом 80 микролитров при контакте с покровным стеклом. Такой подход позволяет концентрировать HUVEC в пределах небольшой площади покровного стекла и тем самым способствует быстрому образованию сливающегося монослоя клеток.

Инкубируйте покровное стекло при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-четырех часов, чтобы дать время клеткам слипнуться в сливающийся монослой. Затем дважды промойте предметные стекла в полной эндотелиальной базальной среде, чтобы удалить все клетки, которые не прикрепились. Чтобы создать край раны на монослое HUVEC, с помощью щипцов аккуратно удерживайте покровное стекло на месте и с силой проведите лезвием бритвы по центру монослоя ячеек.

Дайте клеткам восстановиться в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Затем соберите и установите покровные стекла для визуализации, как и раньше. Получение фазово-контрастных изображений с интервалом в 10 минут в течение 12 часов с помощью фазового объектива с 10-кратной числовой апертурой 0,45 и конденсатора с большим рабочим расстоянием с числовой апертурой 0,52.

Используйте панель «Захват нейтральной плотности» программы для получения изображений. Наконец, количественно оцените ветвление и миграцию HUVEC, как описано в сопроводительном документе. HUVECs трансфицировали для экспрессии меченного mApple EB3, белка, связывающего конец микротрубочки, и были получены покадровые изображения.

Необработанные изображения EB3 показаны слева. Синие кометы EB3, отслеживаемые программным обеспечением plusTipTracker, показаны справа. Кометы, обнаруженные в каждом кадре, были связаны на основе изменения их положения от кадра к кадру для создания треков EB3 и визуального наложения трека EB3, как показано здесь.

Медленный, кратковременный рост микротрубочек показан красным цветом, медленный, долгоживущий рост микротрубочек показан зеленым, быстрый, кратковременный рост микротрубочек показан желтым, а быстрый, долгоживущий рост микротрубочек показан синим. Для анализа ветвления эндотелиальных клеток было получено изображение DIC и флуоресцентное изображение отдельного HUVEC при 60-кратном увеличении. На флуоресцентном изображении граница была проведена вручную вокруг края клетки.

Затем начало ветвей определялось путем проведения прямой линии поперек ветви и через наибольший угол кривизны по обе стороны от ветви. Ветви, которые были длиннее их ширины и не менее 10 микрон в длину, подсчитывались, и измерялась длина от начала ветви до дистального кончика ветви. Для оценки миграции эндотелиальных клеток по краю раны HUVEC культивировали с высокой плотностью, а после ранения проводили визуализацию живых клеток, как описано в этом видео.

Как показано на рисунке, эндотелиальные клетки края раны мигрировали направленно в область раны. Это движение было проанализировано с использованием ядрышка в качестве фидуциарного маркера для отслеживания скорости миграции, персистенции и расстояния. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как культивировать, трансфектировать и препарировать HUVEC для экспериментов по визуализации формы клеток и динамики цитоскелета или для исследований миграции клеток с края раны.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как конъюгация полиакриламида или коллагена, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с вовлечением клеток модифицированными ВКМ. Спасибо за просмотр, и удачи в ваших экспериментах.