Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

Общая цель данной процедуры заключается в культивировании эндотелиальных клеток пупочной вены человека и анализе динамики цитоскелета и миграции клеток с помощью таймлапс-визуализации живых клеток. Методы, описанные в этом видео, могут помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной, молекулярной и механобиологии. Например, данный протокол может быть использован для определения того, как форма и подвижность клеток модулируются при взаимодействии с различными компонентами внеклеточного матрикса (ECM).

Визуальная демонстрация имеет решающее значение, поскольку этапы подготовки образцов сложны в исполнении. Они требуют точного и своевременного манипулирования клетками на протяжении всего процесса. Хотя данный метод позволяет изучить подвижность эндотелиальных клеток в ходе ангиогенеза, он также может быть применен для микроскопических исследований практически любой модели адгезивных клеточных систем.

С помощью пинцета возьмите покровное стекло из банки для хранения со 100% этанолом и пронесите его через пламя горелки Бунзена для стерилизации. Затем поместите его в чашку Петри диаметром 35 миллиметров. Подготовьте по одному покровному стеклу для каждого образца.

В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл добавьте 10 µL стокового раствора фибронектина в концентрации 1 mg/mL и 990 µL PBS. Затем нанесите пипеткой по 250 µL этого раствора на каждое покровное стекло. Равномерно распределите раствор по всей поверхности.

Инкубируйте покровные стекла минимум три часа при 37 °C. Перед использованием промойте каждое покровное стекло три раза 2 мл PBS. С помощью гемоцитометра определите количество культивируемых HUVEC и перенесите в микроцентрифужную пробирку объем, содержащий 100 000 клеток на одно покровное стекло для экспериментов без миграции или 500 000 клеток на одно покровное стекло для экспериментов с миграцией.

Центрифугируйте клетки при 1 400 ×g в течение четырех минут для осаждения. После центрифугирования для каждого тестируемого условия ресуспендируйте до одного миллиона клеток в 100 µL буфера для электропорации и смешайте их с одним микрограммом кДНК. Перенесите клетки в кювету для электропорации.

Проведите трансфекцию смеси клеток и ДНК, используя программу, предназначенную для электропорации HUVEC. Затем восстановите трансфецированные клетки, добавив 500 µL полной базовой среды для эндотелия. После этого перенесите соответствующий объем клеток на покровные стекла, покрытые фибронектином.

Инкубируйте клетки при 37 °C в течение трех-четырех часов, чтобы обеспечить экспрессию конструкций кДНК. В preparation к визуализации возьмите две полоски двустороннего скотча размером 2,5 см на 0,65 см и закрепите их горизонтально вдоль верхнего и нижнего краев чистого предметного стекла. Обратите внимание, что важно оставить небольшой зазор между скотчем и краем стекла для герметизации камеры.

Установите покровное стекло стороной с клетками вниз так, чтобы два его края опирались на ленту. С помощью пинцета осторожно прижмите стекло для надежной фиксации. С помощью микропипетки добавьте 40 µL среды для визуализации в пространство между покровным стеклом и предметным стеклом.

Убедитесь, что пространство между покровным стеклом и предметным стеклом полностью заполнено средой для визуализации. При необходимости удалите излишки среды бумажной салфеткой. Загерметизируйте все края предметного стекла теплым VALAP.

Проверьте наличие утечек, осторожно нажав на стеклянное покровное стекло. Поместите препарат с закрепленным и загерметизированным покровным стеклом на предметный столик микроскопа, предварительно нагретый до 37 °C. Используя конфокальный микроскоп с вращающимся диском, зарегистрируйте последовательности изображений в режиме таймлапс, изображения с синим флуоресцентным белком и изображения в режиме DIC.

Проанализируйте динамику микротрубочек и их колокализацию, как описано в сопроводительном документе. Для проведения анализа миграции клеток после этапа электропорации восстановите трансфицированные клетки, добавив 80 µL полной базальной среды для эндотелия. Затем перенесите весь образец объемом 80 µL в виде одной капли в центр высушенного покровного стекла, покрытого фибронектином.

Не распределяйте каплю. Высушивание покровного стекла необходимо для того, чтобы капля объемом 80 µL не разделялась при контакте с ним. Такой подход позволяет сконцентрировать HUVECs на небольшой площади покровного стекла, что способствует быстрому формированию сплошного монослоя клеток.

Инкубируйте покровное стекло при 37 °C в течение трех-четырех часов, чтобы клетки успели прикрепиться и образовать сплошной монослой. Затем дважды промойте стекла полной базальной средой для эндотелиальных клеток, чтобы удалить все неприкрепившиеся клетки. Чтобы создать край раны на монослое HUVEC, аккуратно зафиксируйте покровное стекло пинцетом и плотно проведите лезвием бритвы по центру монослоя клеток.

Дайте клеткам восстановиться в инкубаторе при 37 °C в течение трех часов. Затем подготовьте и закрепите покровные стекла для визуализации, как описано ранее. Получайте изображения в фазовом контрасте с интервалом в 10 минут в течение 12 часов, используя фазовый объектив 10X с числовой апертурой 0,45 и конденсатор с большой рабочей дистанцией и числовой апертурой 0,52.

Используйте панель ND Acquisition программы для сбора изображений. В завершение количественно оцените ветвление и миграцию HUVEC, как описано в сопроводительном документе. HUVEC были трансфецированы для экспрессии mApple-labeled-EB3, белка захвата концов микротрубочек, после чего были получены изображения в режиме таймлапс.

Слева представлены исходные изображения EB3. Справа показаны синие кометы EB3, отслеженные с помощью программного обеспечения plusTipTracker. Кометы, обнаруженные в каждом кадре, были связаны на основе изменения их положения от кадра к кадру для создания треков EB3 и визуального наложения треков EB3, как показано здесь.

Медленный, кратковременный рост микротрубочек показан красным цветом, медленный, длительный рост микротрубочек — зеленым, быстрый, кратковременный рост микротрубочек — желтым, а быстрый, длительный рост микротрубочек — синим. Для анализа ветвления эндотелиальных клеток были получены DIC-изображение и флуоресцентное изображение отдельной клетки HUVEC при 60-кратном увеличении. На флуоресцентном изображении вручную была обведена граница края клетки.

Затем определяли места отхождения ветвей, проводя прямую линию поперек ветви через наибольший угол искривления с каждой стороны. Подсчитывались ветви, длина которых превышала их ширину и составляла минимум 10 мкм; длина измерялась от места отхождения ветви до ее дистального конца. Для оценки миграции эндотелиальных клеток к краю раны HUVECs культивировали при высокой плотности, после чего проводили таймлапс-визуализацию живых клеток после нанесения повреждения, как описано в данном видео.

Как показано здесь, эндотелиальные клетки края раны направленно мигрировали в область раны. Это движение анализировалось с использованием ядрышка в качестве фидуциарного маркера для отслеживания скорости, персистентности и дистанции миграции. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как культивировать, трансфицировать и подготавливать HUVEC для экспериментов по визуализации формы клеток и динамики цитоскелета или для исследований миграции клеток на краю раны.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как конъюгация с полиакриламидом или коллагеном, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся взаимодействия клеток с модифицированным внеклеточным матриксом. Спасибо за просмотр, и удачи в ваших экспериментах.