Подробный протокол Характеризуя клеточной линии мышиной C1498 и его модель Associated Лейкоз Mouse

Общая цель данной процедуры — охарактеризовать мышиные клетки C1498 и острый лейкоз, который они индуцируют после внутривенного введения мышам. Основное преимущество данной процедуры заключается в том, что мышиный миеломоноцитарный лейкоз, вызванный инъекцией клеток C1498, обладает многими признаками заболевания у человека. Эта модель животного может помочь ответить на ключевые вопросы в области гематологии, такие как механизмы, приводящие к развитию лейкоза и иммунодефицита.

Значение данной животной модели распространяется на лечение лейкоза, поскольку она облегчает тестирование новых химиотерапевтических и иммунотерапевтических препаратов. Начните с переноса самки конгенной мыши линии C57 black 6 в возрасте от пяти до шести недель в стерильный ламинарный шкаф. Затем поместите животное в фиксатор.

Затем наполните шприц объемом 1 мл, оснащенный иглой 29G, 100 µL клеточной суспензии. Зафиксируйте хвост в дистальной части и продезинфицируйте кожу хвоста марлей, смоченной в 70% ethanol. Медленно введите 1 × 10⁶ клеток в латеральную хвостовую вену.

После введения всех клеток извлеките иглу и осторожно прижмите стерильную марлю к месту инъекции. Затем верните животное в клетку, обеспечив тщательный мониторинг в течение следующих нескольких недель. Через 17–19 дней введите капиллярную трубку в медиальный кант глаза анестезированного животного с лейкемией.

Из орбитального синуса в капиллярную трубку будет отобрано от 100 до 200 µL крови. Извлеките трубку и остановите кровотечение, осторожно прижав к глазу стерильную марлевую салфетку. Затем перенесите кровь в пробирку с ЭДТА и храните ее на льду до начала изоляции мононуклеарных клеток.

Для выделения мононуклеарных клеток крови сначала добавьте PBS с добавлением 1 мМ EDTA до достижения конечного объема 500 µL. Затем перенесите образец в микроцентрифужную пробирку. Далее, используя шприц объемом 1 мл с иглой 30G, аккуратно внесите 500 µL разделяющего раствора под кровь, стараясь не смешивать слои.

Отделите клетки путем центрифугирования и с помощью пипетки перенесите непрозраный белый слой мононуклеарных клеток в новую микроцентрифужную пробирку. Затем промойте иммунные клетки в 1 мл PBS. Центрифугируйте их и повторно суспендируйте осадок в 600 мкл буфера FACS для окрашивания и анализа методом проточной цитометрии.

Для выделения костного мозга положите мышь на спину на пластическую доску и зафиксируйте конечности животного. Дезинфицируйте животное 70% этанолом. Затем сделайте разрез на каждой ноге в верхней части бедренной кости выше сустава и осторожно потяните за большеберцовые кости, чтобы отделить их от бедренных.

С помощью пинцета и ножниц удалите кожу и мышцы с костей, затем перенесите кости в чашку Петри на льду. С помощью ножниц удалите конечности. Затем введите иглу калибра 26, прикрепленную к 10-миллилитровому шприцу с пятью миллилитрами холодного PBS, в конец каждой кости по очереди и промойте костный мозг в чашку.

Пропустите клеточную суспензию через кончик иглы несколько раз, чтобы разрушить клетки костного мозга. Затем профильтруйте клетки через новый фильтр с размером пор 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл для получения суспензии одиночных клеток. Центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте осадок в двух миллилитрах лизирующего буфера.

Немедленно заполните пробирку холодным PBS до объема 50 миллилитров и центрифугируйте клетки. Затем ресуспендируйте осадок костного мозга в холодном буфере для FACS до концентрации 1 × 10⁶ клеток на миллилитр. Чтобы подготовить клетки костного мозга к окрашиванию, сначала поместите предметные стекла в одноразовые камеры с предварительно установленными фильтрующими картами, а затем поместите камеры в цитоцентрифугу.

Добавьте 100 µL буфера для FACS в каждую камеру фильтр-карты и кратковременно центрифугируйте предметные стекла. По окончании центрифугирования добавьте 100 µL клеточной суспензии в каждую камеру и центрифугируйте клетки. Затем аккуратно извлеките предметные стекла из камер для высушивания на воздухе.

Для окрашивания клеток костного мозга погрузите предметные стекла в коплин-стакан с раствором Май-Грюнвальда на пять минут. Затем перенесите стекла в стакан с буферным раствором (pH 6,8) на одну минуту. После этого перенесите стекла в раствор Гимзы R на 10 минут.

Затем следует промывка pH-нейтральной водой в течение 10 секунд. После промывки дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе и нанесите одну каплю среды для заключения на каждый образец. Затем приложите один край покровного стекла к предметному стеклу и осторожно опустите его на клетки, слегка нажимая, чтобы удалить все пузырьки воздуха.

По сравнению с животными контрольной группы, у животных, которым вводили клетки C1498, наблюдается массивная инфильтрация клеток C1498 в костный мозг, что проявляется в бластном виде клеток. Инфильтрующие костный мозг клетки C1498 демонстрируют моноцитарный и гранулоцитарный фенотипы, характерные для монобластов и миелобластов соответственно, что типично для острого миеломоноцитарного лейкоза. Проточный цитометрический анализ частоты мононуклеарных клеток в образцах крови мышей, которым вводили C1498, показывает, что примерно четверть всей популяции лейкоцитов составляют лейкемические клетки.

Частота T- и B-лимфоцитов схожа у контрольных животных и животных, которым вводили C1498. Однако у мышей, которым вводили C1498, наблюдается более высокий уровень моноцитов, что является характерным признаком острого миеломоноцитарного лейкоза. При проведении цитохимического анализа и окрашивания по методу Май-Грюнвальда-Гимзы важно соблюдать соответствующие значения pH, температурный режим и время инкубации.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как характеризовать острый миеломоноцитарный лейкоз. После разработки эта методика открыла исследователям в области гематологии путь к изучению природы спонтанного и индуцированного острого лейкоза на других моделях животных.