Подробный протокол Характеризуя клеточной линии мышиной C1498 и его модель Associated Лейкоз Mouse

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы охарактеризовать мышиные клетки C1498 и острый лейкоз, который они вызывают после внутривенной инъекции у мышей. Основное преимущество этой процедуры заключается в том, что мышиный миеломоноцитарный лейкоз, вызванный после инъекции клеток C1498, имеет многие признаки заболевания человека. Эта животная модель может помочь ответить на ключевые вопросы в области гематологии, например, каковы механизмы, приводящие к развитию лейкемии и иммунодефициту.

Применение этой животной модели распространяется на лечение лейкемии, поскольку она облегчает тестирование новых химиотерапевтических и иммунотерапевтических агентов. Начните с перевода пяти-шестинедельной самки конгенной мыши C57 black 6 в стерильный капюшон с ламинарным потоком. Затем поместите животное в удерживающее устройство.

Далее загрузите одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 29 калибра, на 100 микролитров ячеек. Возьмитесь за хвост дистального конца и продезинфицируйте кожу хвоста марлей, смоченной на 70% этаноле. Продолжайте медленно вводить от 10 до 10 до шестой клетки в боковую хвостовую вену.

Когда все клетки будут доставлены, извлеките иглу и слегка надавите под видом инъекции стерильной марлей. Затем верните животное в клетку с тщательным наблюдением в течение следующих нескольких недель. Через 17-19 дней вставьте капиллярную трубку в медиальный кантус глаза животного, находящегося под наркозом.

От 100 до 200 микролитров крови будет взято из ротального синуса в капиллярную трубку. Извлеките трубку и остановите кровотечение, аккуратно наложив стерильную марлевую губку на глаз. Затем переложите кровь в пробирку с ЭДТА и храните пробирку на льду до тех пор, пока мононуклеарные клетки не будут изолированы.

Для выделения мононуклеарных клеток крови сначала добавляют ПБС с добавлением одного миллимолярного ЭДТА до конечного объема 500 микролитров. Затем перенесите образец в микроцентрифужную пробирку. Затем с помощью одномиллилитрового шприца, оснащенного иглой 30 калибра, осторожно нанесите 500 микролитров разделительного раствора под кровь, стараясь не перемешать слои.

Разделите клетки центрифугированием и с помощью пипетки перенесите непрозрачный слой белых мононуклеаров в новую микроцентрифужную пробирку. Затем промойте иммунные клетки в одном миллилитре PBS. Центрифугируйте их и повторно суспендируйте гранулу в 600 микролитрах буфера FACS для окрашивания и анализа методом проточной цитометрии.

Чтобы изолировать костный мозг, положите мышь на спину на пластиковую доску и закрепите конечности животного. Продезинфицируйте животное 70%-ным этанолом. Затем разрежьте каждую ногу в верхней части бедренной кости над суставом и аккуратно потяните за голени, чтобы отсоединить их от бедренных костей.

С помощью щипцов и ножниц удалите кожу и мышцы с костей и перенесите кости в чашку Петри на льду. С помощью ножниц удалите конечности. Затем вставьте иглу 26 калибра, прикрепленную к 10-миллилитровому шприцу, содержащему пять миллилитров холодного PBS, в конец одной кости за раз и промойте костный мозг в чашку.

Пропустите клеточную суспензию через кончик иглы несколько раз, чтобы разрушить клетки костного мозга. Затем отфильтруйте клетки через новый фильтр 70 микрон в коническую трубку объемом 50 миллилитров, чтобы получить суспензию для одной клетки. Центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах буфера для лизиса.

Немедленно заполните пробирку до 50 миллилитров холодного PBS и центрифугируйте ячейки. Затем повторно суспендируйте гранулу костного мозга в соотношении от 10 до 6 клеток на миллилитр в холодном буфере FACS. Чтобы подготовить клетки костного мозга к окрашиванию, сначала поместите предметные стекла в одноразовые камеры с предварительно прикрепленными фильтрующими картами и поместите камеры в цитоцентрифугу.

Добавьте 100 микролитров буфера FACS в каждую камеру фильтрующей карты и кратко центрифугируйте предметные стекла. В конце отжима добавьте по 100 микролитров клеток в каждую камеру и центрифугируйте ячейки. Затем осторожно выньте предметные стекла из камер для сушки на воздухе.

Чтобы окрашивать клетки костного мозга, погрузите предметные стекла в банку с коплином, содержащую раствор Май-Грюнвальда, на пять минут. Далее переложите предметные стекла в банку с буферным раствором с pH 6,8 на одну минуту. Затем перенесите слайды в раствор Giemsa R на 10 минут.

Затем следует 10-секундное умывание водой с нейтральным pH. После промывки дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе и нанесите по одной капле монтажного средства на каждый образец. Затем поместите один край защитного стекла на предметное стекло и осторожно опустите защитное стекло на ячейки, осторожно надавливая, чтобы удалить пузырьки воздуха.

По сравнению с контрольными животными, животные, которым вводили клетки C1498, демонстрируют массивную инфильтрацию клеток C1498 в костном мозге, о чем свидетельствует бластный вид клеток. Инфильтрирующие клетки C1498 костного мозга демонстрируют моноцитарный и гранулоцитарный фенотипы, свидетельствующие о монобластных и миелобластических клетках соответственно, характерные для острого миеломоноцитарного лейкоза. Проточный цитометрический анализ частот мононуклеарных клеток в образцах крови мышей, получавших инъекцию C1498, показывает, что примерно четверть всей популяции белых кровяных клеток состоит из лейкозных клеток.

Частоты Т- и В-лимфоцитов схожи у животных контрольной группы и животных, которым вводили C1498. Частота моноцитов, однако, наблюдается на более высоких уровнях у мышей, которым вводили C1498, что является особенностью острого миеломоноцитарного лейкоза. При выполнении процедур цитохимии и Май-Грюнвальда-Гимзы важно помнить о необходимости поддержания соответствующих значений pH, температуры и времени инкубации.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как охарактеризовать острый миеломоноцитарный лейкоз. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области гематологии к изучению природы спонтанного и индуцированного острого лейкоза на других животных моделях.