Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Общая цель данного эксперимента заключается в высокоэффективной и воспроизводимой дифференцировке человеческих плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты. Данный протокол может быть масштабирован в биореакторе или модифицирован для дифференцировки клеточных линий, чувствительных к культивированию единичных клеток. Этот метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы моделирования сердечных заболеваний с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

Основными преимуществами этого метода являются его экономическая эффективность, высокая производительность, воспроизводимость и применимость как для эмбриональных, так и для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Сегодняшний демонстрирующий — Ханане Фонуди, в настоящее время аспирантка Института сердечных исследований Виктора Чанга из Института Ройан. Перед нанесением покрытия используйте чистящую щетку и дистиллированную воду, чтобы тщательно удалить всю пыль или остатки культур из 100-миллилитровой колбы-спиннера со стеклянным подвесом.

Затем наполните колбу 70% ethanol. Через 30 минут промойте колбу дистиллированной водой и заполните ее пятимолярным раствором sodium hydroxide. На следующее утро промойте колбу под проточной водой в течение пяти минут и заполните ее одномолярной hydrochloric acid.

Через 15 минут промойте колбу под проточной водой еще в течение пяти минут, после чего дважды промойте её дважды дистиллированной водой. Поместите колбу в бокс биологической безопасности для высушивания. Затем добавьте в колбу 1,5 мл силиконизирующего раствора и вращайте колбу по горизонтали, чтобы покрыть все поверхности силиконом.

Нагревайте покрытую колбу в сухом шкафу в течение одного часа при 100 °C. После охлаждения колбы промойте ее деионизированной водой трижды по 15 минут. Затем стерилизуйте контейнер в автоклаве при 121 °C в течение 20 минут.

После пассирования недифференцированных сфероидов методом пассирования отдельных клеток не менее трех раз, с помощью пятимиллилитровой пипетки перенесите все недифференцированные сфероиды в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте лунки одним миллилитром среды для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека, чтобы собрать оставшиеся сфероиды, и объедините промывочную жидкость с собранными сфероидами. Оставьте сфероиды на пять минут для осаждения с целью формирования рыхлого осадка.

Затем аспирируйте супернатант, стараясь не удалить сфероиды. После этого промойте сфероиды одним миллилитром PBS в течение пяти минут и инкубируйте их в 5 миллилитрах Trypsin EDTA при 37 °C. Через четыре-пять минут остановите реакцию, добавив один миллилитр среды для эмбриональных стволовых клеток человека, и с помощью пипетки P1000 диссоциируйте сфероиды до получения суспензии одиночных клеток.

После подсчета методом исключения трипанового синего ресуспендируйте клетки в кондиционированной среде, дополненной основным фактором роста фибробластов и ингибитором ROCK, до концентрации 200 000 клеток на мл и перенесите 100 мл клеточной суспензии в силиконизированный флакон биореактора. Поместите флакон на перемешивающее устройство при скорости 35 RPM. Через 24 часа увеличьте скорость перемешивания до 40 RPM.

Через 48 часов прекратите перемешивание на пять-десять минут, пока все реформированные сфероиды не осядут на дно колбы, и замените половину среды на кондиционированную среду с добавлением основного фактора роста фибробластов. Затем снова запустите перемешиватель на 40 RPM еще на 24 часа, заменяя половину среды тем же способом ежедневно в течение следующих трех дней. На пятый день остановите перемешиватель на пять-десять минут.

Затем перенесите все сфероиды в пробирку объемом 50 мл с 50 мл или меньшим объемом среды. Удалите оставшуюся в колбе среду, убедившись, что в сосуде не осталось сфероидов. Затем осторожно удалите супернатант с осевших сфероидов и промойте клеточные кластеры 25 мл PBS с кальцием и магнием.

Через пять-десять минут удалите промывочный раствор и ресуспендируйте сфероиды в 40 миллилитрах среды RPMI-B27 с добавлением ингибитора киназы гликогенсинтазы-3, ингибитора ROCK и поливинилового спирта. Перенесите все сфероиды обратно во флакон биореактора. Затем добавьте свежую среду RPMI-B27 до общего объема 100 миллилитров и возобновите перемешивание со скоростью 40 RPM.

Через 24 часа повторите ту же процедуру для замены среды на среду RPMI-B27. Спустя еще 24 часа снова повторите этот процесс, заменив среду на RPMI-B27 с добавлением IWP2, пурморфамина и SB43. Оставьте на 48 часов.

Первые сокращения обычно наблюдаются через семь дней. Для быстрой дифференцировки линий плюрипотентных стволовых клеток человека, не адаптированных к культивированию единичных клеток, сначала обработайте культуру плюрипотентных стволовых клеток человека с конфлюэнтностью 70–80%, выращенную на клетках эмбриональных фибробластов мыши, 5 миллилитрами раствора для диссоциации в течение 30–60 секунд. Раствор для диссоциации следует оставить только до тех пор, пока MEF не округлятся, а края колоний hPSC не станут четкими.

Если оставить клетки на слишком длительный срок, они не подвергнутся правильной дифференцировке. В подходящий момент быстро замените раствор для диссоциации 75 миллилитрами коллагеназы IV типа и инкубируйте клетки от 5 до 15 минут при 37 °C, каждые несколько минут проверяя культуру под микроскопом. Когда целые колонии начнут отделяться, замените коллагеназу 1,5 миллилитрами среды для эмбриональных стволовых клеток человека и с помощью дозатора P1000 осторожно отделите целые колонии клеток от дна планшета.

Клетки следует отделять осторожно, чтобы колонии не распадались на мелкие фрагменты. Затем с помощью пятимиллилитровой пипетки перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и промойте лунки одним миллилитром среды для эмбриональных стволовых клеток человека, собирая все оставшиеся клетки в пробирке объемом 15 мл. После пяти минут седиментации осторожно замените супернатант двумя миллилитрами свежей среды для эмбриональных стволовых клеток человека с добавлением основного фактора роста фибробластов.

Используя новую пипетку на 5 мл, перенесите клетки в планшет с ультранизкой адгезией и инкубируйте колонии от 6 до 12 часов. По окончании инкубации с помощью пипетки на 5 мл осторожно перенесите агрегаты колоний в новую пробирку на 15 мл и соберите оставшиеся агрегаты, промыв среду RPMI-B27. После того как колонии осядут, замените супернатант свежей средой RPMI-B27, дополненной ингибитором гликогенсинтазы-киназы-3, и осторожно перенесите колонии на планшеты, покрытые ламинином, для адгезии при 37 °C.

Через 24 часа замените среду на среду RPMI-B27. Еще через 24 часа замените среду на RPMI-B27, содержащую IWP2, пурморфамин и SB43. Первые сокращения обычно наблюдаются через семь дней.

На сегодняшний день протокол дифференцировки в статической суспензии был протестирован на пяти линиях эмбриональных стволовых клеток человека и четырех линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, что привело к получению более 90% сокращающихся сфероидов от каждой линии, демонстрируя высокую воспроизводимость данного протокола для различных линий плюрипотентных стволовых клеток человека. Дифференцирующиеся сфероиды проявляют схожее поведение в среде биореактора с перемешиваемой суспензией, как и в статической системе, при этом примерно 100% сфероидов начинают сокращаться к 10-му дню. Действительно, срезы сокращающихся сфероидов, собранные на 30-й день, выявляют цитоплазматическую и ядерную экспрессию сердечного тропонина T и сердечного фактора транскрипции NKX2.5 соответственно.

Кроме того, при замене недифференцированных сфероидов недифференцированными клеточными агрегатами сокращающиеся кластеры появляются через семь дней после начала дифференцировки. В 42 протестированных линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека к 15-му дню доля клеток, положительных по сердечному тропонину T, составляла в среднем более 60%. Сокращающиеся кластеры также демонстрируют цитоплазматическую экспрессию сердечного тропонина T и ядерную экспрессию NKX2.5, аналогичные тем, что наблюдались для сфероидов, полученных в биореакторе с перемешиванием суспензии.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использования hPSCs, которые были адаптированы к культивированию единичных клеток в течение как минимум трех пассажей перед дифференцировкой в биореакторе. Эту процедуру можно сочетать с другими методами обогащения кардиомиоцитов для получения чистой популяции клеток. Данный метод проложил путь к коммерциализации кардиомиоцитов, полученных из hPSC.

Данный метод обладает потенциалом применения в клинической практике, фармацевтике, тканевой инженерии, а также при разработке органов или органоидов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как эффективно дифференцировать плюрипотентные стволовые клетки человека в кардиомиоциты и масштабировать культивирование в биореакторе.