Интерференция РНК на основе Исследование функции белка теплового шока 27 во время роговичного эпителиального заживление ран

Общей целью данного анализа трансфекции РНК является использование специфической малой интерферирующей РНК HSP27 для оценки потенциальной роли HSP27 в заживлении эпителиальных ран роговицы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся функции белка теплового шока 27 в процессе заживления эпителиальных ран. Основное преимущество этого метода заключается в том, что малая интерферирующая РНК представляет собой чувствительную РНК-сахарозу, созданную специально для нацеливания на транскрипт матричной РНК, чтобы вызвать его деградацию.

Он был использован для идентификации новых вредителей в пространстве различных клеточных процессов. Хотя этот метод может дать представление о заживлении эпителиальных ран роговицы, он также может применяться к другим системам, таким как кожа и слизистая оболочка. Демонстрировать процедуру будет Сун-Сук Канг, техник из моей лаборатории.

Чтобы начать эту процедуру, культивируйте эпителиальные клетки роговицы человека в шестилуночной пластине со средой для роста бронхиального эпителия при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до их 95-процентного слияния. Далее разведите 2,5 микролитра, или 7,5 микролитров реагента для трансфекции со 100 микролитрами восстановленной сывороточной среды для трансфекции. Затем растворите специфичную для HSP27 миРНК и скремблированную контролируемую миРНК в 100 микролитрах или восстановленной сывороточной среде, чтобы получить 10 наномоляров специфической миРНК HSP27 и 15 наномоляров скремблированной контрольной миРНК соответственно.

После этого смешайте 100 микролитров раствора миРНК со 100 микролитрами разведенного реагента для трансфекции и выдержите смесь в течение 15 минут при комнатной температуре. Впоследствии добавить в клетки липидные комплексы миРНК. После четырехчасовой инкубации смените среду на полную среду для роста бронхиального эпителия и инкубируйте клетки в течение двух дней при температуре 37 градусов Цельсия перед анализом вестерн-блоттинга.

На этом этапе экстрагируют специфические HSP27 и перемешанные контрольные миРНК HCECs в шкафу биологической безопасности с использованием 100 микролитров ледяного буфера для лизиса. Затем инкубируйте клетки в течение 30 минут на льду, чтобы вызвать лизис клеток. Затем центрифугируйте лизаты в 10 000 раз G в течение 15 минут.

Впоследствии переложите надосадочную жидкость в свежие пробирки объемом 1,5 миллилитра и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. После этого определите концентрацию белка в клеточных литатах с помощью анализа белка Брэдфорда. Затем загрузите образцы равным количеством общих клеточных белков в 10-процентный или 12-процентный акриламидный гель.

Поместите гель на страницу SDS и электрофоретически перенесите разделенные белковые полосы на нитроцеллюлозные фильтры с током 200 миллиампер в течение одного часа и четырех градусов Цельсия. Затем закройте фильтрующие мембраны нитроцеллюлозы пятипроцентным обезжиренным молоком в TBST на один час. Затем добавьте первичные антитела и инкубируйте мембраны в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на шейкере.

На следующий день промойте мембраны три раза с TBST, оставляя десять минут на каждую промывку. Затем определите иммунореактивные полосы с помощью конъюгированных антител к пероксидазе хрена у коз в пятипроцентном BSA. Впоследствии инкубируйте мембраны в вестерн-блоттинге люминоловых реагентов в течение одной минуты при комнатной температуре.

Снимите мембрану с раствора реагента. Затем удалите лишнюю жидкость впитывающим полотенцем и поместите их в протектор из пластикового листа. После этого поместите покрытую мембрану в пленочную кассету стороной белка вверх.

Поместите рентгеновскую пленку поверх мембран и экспонируйте ее в течение одной минуты. В шкафу биологической безопасности сделайте рану, проведя стерильным наконечником пипетки по сливающимся культурам специфических HSP27 или скремблированных контрольных миРНК-трансфицированных HCEC. Сразу после ранения клетки дважды промыть 1XPBS и выдержать их в среде роста бронхиального эпителия при температуре 37 градусов Цельсия и пятипроцентном углекислом газе в течение 24 часов.

Через 24 часа после ранения сделайте снимок HCECs с помощью вертикального микроскопа при 100-кратном увеличении и выполните выравнивание фона с помощью команды filter в программном обеспечении для анализа изображений. С помощью команды выбора измерений определите область интереса с многоугольной формой того же размера, которая может покрывать начальную рану перпендикулярно от конца до конца. Затем определите три различные области интереса в области ранения каждого образца.

Автоматически подсчитывайте номер ячейки в каждом поле с помощью пункта меню «Измерять размер». Показанный здесь вестерн-блоттинг показал, что экспрессия фосфорилированного HSP27 и фосфорилированного Akt была значительно снижена. В то время как экспрессия спинок была значительно увеличена в HSP27, специфические миРНК трансфицировали HCECs.

Фосфорилированная экспрессия HSP27 была снижена на 30 и 40 процентов в 10 наномолярах и 15 наномолярах HSP27-специфичных для HSP27 клеток, трансфицированных соответственно, по сравнению с контрольными клетками, трансфицированными миРНК. Кроме того, экспрессия нефосфорилированного HSP27 была снижена на 20 и 30 процентов в десяти и 15 наномолярах специфических миРНК клеток, трансфицированных HSP27 соответственно. Направленный анализ раны, вызванный царапинами, показал, что через 24 часа после ранения специфические для HSP27 миРНК трансфицированные клетки на 10 и 15 наномолярных эксибитах замедлили миграцию.

Кроме того, HSP27-специфичные миРНК-трансфицированные HCEC подвергались большей апоптотической и некротической гибели клеток по сравнению с скремблированными контрольными миРНК-трансфицированными клетками, показанными с помощью проточной цитометрии. После освоения техники трансфекции РНК ее можно провести за 24 часа, если она выполнена правильно. После этих процедур может быть сгенерирован эпизод, подобный блокировке рта, чтобы ответить на дополнительный вопрос, например, о начальной функции белка теплового шока 27 в заживлении эпителиальных ран роговицы.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как использовать специфическую малую интерферирующую РНК белка теплового шока 27 для оценки потенциальной роли белка теплового шока 27 в заживлении эпителиальных ран роговицы. Не забывайте, что работа с малыми интерферирующими РНК и реагентами может быть опасной, поэтому при выполнении этих процедур всегда следует использовать прекурсоры, такие как шкаф биологической безопасности и защитная маска.