Gap Junctional межклеточной коммуникации: Функциональная биомаркеров для оценки неблагоприятного воздействия токсикантов и токсинами, и Польза для здоровья натуральных продуктов
25 декабря 2016 г.
Этот протокол описывает скальпель погрузо-флуоресцентный краситель метод передачи, который измеряет межклеточной коммуникации через щелевых контактов каналов. Gap узловой межклеточной связи является одним из основных клеточный процесс, с помощью которого гомеостаз ткани сохраняется и нарушение этой клеточной сигнализации имеет неблагоприятные последствия для здоровья.
Общая цель состоит в том, чтобы обеспечить простой анализ для измерения межклеточной коммуникации через популяцию клеток млекопитающих, которые могут обслуживать широкий спектр фармакологических и токсикологических потребностей in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области токсикологии, например, влияет ли соединение на развитие или поддержание ткани, нарушая межклеточную коммуникацию. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он предлагает простую и быструю оценку функции щелевого перехода в большой популяции клеток в ответ на токсиканты и токсины.
Демонстрировать процедуру будет Ажна Узуни, научный сотрудник бакалавриата из моей лаборатории. Чтобы начать эксперимент, трижды по 10 раз в пятую часть эпителиальных клеток печени крысы WB-F344 помещайте в культуральные планшеты диаметром 35 мм, содержащие модифицированную среду Eagle плюс 5% фетально-бычьей сыворотки. Культивируйте клетки в инкубаторе до тех пор, пока они не достигнут 100% слияния, и продолжайте экспериментальную обработку клеток.
Чтобы продолжить эксперименты по схеме «доза-реакция», добавьте 10 микролитров и 20 микролитров ранее приготовленного двухмиллимолярного стокового раствора фенантрена в 100% ацетонитриле и четыре микролитра, шесть микролитров и восемь микролитров 20-миллимолярного стокового раствора фенантрена в 100%-ном ацетонитриле в три клеточные пластины, содержащие два миллилитра питательной среды на каждый добавленный объем стокового раствора. Затем добавьте четыре микролитра, шесть микролитров, восемь микролитров, 10 микролитров и 20 микролитров 100% раствора ацетонитрила в три пластины клеток, содержащие два миллилитра питательной среды, на каждый добавленный объем раствора ацетонитрила, который будет служить в качестве средства управления транспортным средством. После добавления ацетонитрила инкубируйте пластины.
Для проведения экспериментов с временной реакцией добавьте семь микролитров 20 миллимолярного стокового раствора фенантрена в 100% ацетонитриле в три пластины клеток, содержащие два миллилитра питательной среды для каждой временной точки. Затем добавьте семь микролитров 100% ацетонитрила к трем пластинам клеток, содержащим два миллилитра питательной среды для каждой временной точки, чтобы они служили в качестве транспортного средства. Инкубируйте планшеты для каждого назначенного момента времени.
Выбросьте питательную среду, аккуратно слив ее. Промойте клетки тремя миллилитрами PBS и либо сцедите, либо аспирируйте между полосканиями. Пипеткой один миллилитр одного миллиграмма на миллилитр растворенного в PBS красителя люциферового желтого цвета в каждой клеточной пластине.
Предварительно загрузите краситель в клетки, зажав скальпель между указательным и большим пальцами. Поместите скальпель перпендикулярно краю культурной пластины и в пяти миллиметрах от него, а затем под действием силы тяжести позвольте скальпелю мягко скатиться от этого перпендикулярного угла до угла 15 градусов. Прокатите лезвие по популяции клеток в трех разных областях общей пластины.
Далее инкубируйте клетки с раствором LY в течение трех минут при комнатной температуре. Сцедите или аспирируйте LY и промойте клетки, чтобы удалить весь внеклеточный краситель и устранить внеклеточную фоновую флуоресценцию. Затем добавьте 0,5 миллилитра 4% фосфатного буферного раствора формалина для фиксации клеток.
Рассматривайте неподвижные клетки с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с 200-кратным увеличением. Выровняйте все пластины так, чтобы линия отступа была параллельна горизонтальному полю зрения. Была получена серия изображений SL-DT эпителиальных клеток печени крысы WB-F344, обработанных возрастающими дозами фенантрена.
Снижение миграции люциферового желтого флуоресцентного красителя вызвано увеличением доз фенантрена, что свидетельствует о возрастающем индуцированном токсикантами ингибировании межклеточной коммуникации через щелевое соединение, или GJIC. Доля контрольных значений, или значений FOC, полученных из изображений SL-DT, была усреднена, статистически проанализирована, а затем построена график. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как вестерн-блоттинг одиночных трансдукционных белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы.
Например, активируют ли эти соединения митогенные события перфорации клеток?
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол описывает технику передачи флуоресцентного красителя с помощью скальпеля, которая измеряет межклеточную связь через каналы разрывных соединений. Этот метод предоставляет простой анализ для оценки разрывно-соединительного межклеточного общения в клетках млекопитающих, что важно для понимания гомеостаза тканей.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Токсикология
Фон
- Разрывно-соединительное межклеточное общение необходимо для поддержания гомеостаза тканей.
- Нарушение этого общения может привести к неблагоприятным последствиям для здоровья.
- Эта техника позволяет быстро оценить функцию разрывных соединений.
- Она может быть применена в различных фармакологических и токсикологических исследованиях.
Цель исследования
- Измерить влияние соединений на разрывно-соединительное межклеточное общение.
- Предоставить надежный метод для оценки развития и поддержания тканей.
- Способствовать исследованиям в области токсикологии относительно воздействия токсинов на клеточное общение.
Использованные методы
- Посеять эпителиальные клетки печени крысы WB-F344 на культуральные пластинки.
- Культивировать клетки до достижения 100% конфлюэнции.
- Применить экспериментальные воздействия на клетки.
- Использовать передачу флуоресцентного красителя для оценки межклеточного общения.
Основные результаты
- Техника позволяет оценить функцию разрывных соединений в больших популяциях клеток.
- Она предоставляет представление о том, как токсичные вещества влияют на межклеточное общение.
- Доказанная эффективность в различных in vitro исследованиях.
- Быстрый и простой протокол повышает эффективность исследований.
Выводы
- Этот метод является ценным инструментом для токсикологических исследований.
- Он помогает понять роль разрывных соединений в здоровье тканей.
- Будущие исследования могут расширить его применение в фармакологии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Gap junctional intercellular communication (GJIC) serves as a functional biomarker for assessing tissue homeostasis disruption by toxicants and evaluating protective effects of natural products. The scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique enables rapid, population-level assessment of GJIC inhibition, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This assay provides predictive confidence for prioritizing compounds based on their impact on cellular communication pathways critical to organ function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking compound exposure to GJIC disruption as a mechanism of toxicity.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of intercellular channel activity in live cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying early biomarkers of adverse effects on tissue maintenance and homeostasis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline GJIC competence.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative dye transfer readouts amenable to automation and high-throughput imaging.
- Scalability: Adapted for in vivo tissue slices and amenable to automated fluorescence microscopy for increased sample throughput.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through conserved GJIC mechanisms across species.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from disrupted intercellular communication rather than off-target effects.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying structure-activity relationships in GJIC modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The SL-DT assay functions as a discovery-stage tool for mechanistic insight, positioned before lead optimization to filter compounds with high tissue disruption risk.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how toxicants or natural products alter intercellular signaling networks.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, population-based functional readouts that reflect tissue-level communication.
- Analytics: Generates fraction of control (FOC) values enabling statistical comparison across doses and time points.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by linking GJIC function to tissue integrity outcomes in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform across toxicology, pharmacology, and nutraceutical development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct functional readout of gap junction channel activity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via simple scalpel loading and fixed-endpoint imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking early GJIC disruption to downstream adverse tissue effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by identifying compounds that preserve intercellular communication homeostasis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescent dye handling, and epifluorescence microscopy.
- Depends on standardized scalpel technique and consistent incubation times for reliable dye transfer.
- Necessitates cross-team agreement on image analysis thresholds and morphometric parameters.
- Adaptable across mammalian cell types and tissue slices with optimization of loading and fixation parameters.
- Limited to assessing functional channel activity; does not distinguish between connexin expression, phosphorylation, or gating states.
