Gap Junctional межклеточной коммуникации: Функциональная биомаркеров для оценки неблагоприятного воздействия токсикантов и токсинами, и Польза для здоровья натуральных продуктов
25 декабря 2016 г.
Этот протокол описывает скальпель погрузо-флуоресцентный краситель метод передачи, который измеряет межклеточной коммуникации через щелевых контактов каналов. Gap узловой межклеточной связи является одним из основных клеточный процесс, с помощью которого гомеостаз ткани сохраняется и нарушение этой клеточной сигнализации имеет неблагоприятные последствия для здоровья.
Общая цель состоит в том, чтобы обеспечить простой анализ для измерения межклеточной коммуникации через популяцию клеток млекопитающих, которые могут обслуживать широкий спектр фармакологических и токсикологических потребностей in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области токсикологии, например, влияет ли соединение на развитие или поддержание ткани, нарушая межклеточную коммуникацию. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он предлагает простую и быструю оценку функции щелевого перехода в большой популяции клеток в ответ на токсиканты и токсины.
Демонстрировать процедуру будет Ажна Узуни, научный сотрудник бакалавриата из моей лаборатории. Чтобы начать эксперимент, трижды по 10 раз в пятую часть эпителиальных клеток печени крысы WB-F344 помещайте в культуральные планшеты диаметром 35 мм, содержащие модифицированную среду Eagle плюс 5% фетально-бычьей сыворотки. Культивируйте клетки в инкубаторе до тех пор, пока они не достигнут 100% слияния, и продолжайте экспериментальную обработку клеток.
Чтобы продолжить эксперименты по схеме «доза-реакция», добавьте 10 микролитров и 20 микролитров ранее приготовленного двухмиллимолярного стокового раствора фенантрена в 100% ацетонитриле и четыре микролитра, шесть микролитров и восемь микролитров 20-миллимолярного стокового раствора фенантрена в 100%-ном ацетонитриле в три клеточные пластины, содержащие два миллилитра питательной среды на каждый добавленный объем стокового раствора. Затем добавьте четыре микролитра, шесть микролитров, восемь микролитров, 10 микролитров и 20 микролитров 100% раствора ацетонитрила в три пластины клеток, содержащие два миллилитра питательной среды, на каждый добавленный объем раствора ацетонитрила, который будет служить в качестве средства управления транспортным средством. После добавления ацетонитрила инкубируйте пластины.
Для проведения экспериментов с временной реакцией добавьте семь микролитров 20 миллимолярного стокового раствора фенантрена в 100% ацетонитриле в три пластины клеток, содержащие два миллилитра питательной среды для каждой временной точки. Затем добавьте семь микролитров 100% ацетонитрила к трем пластинам клеток, содержащим два миллилитра питательной среды для каждой временной точки, чтобы они служили в качестве транспортного средства. Инкубируйте планшеты для каждого назначенного момента времени.
Выбросьте питательную среду, аккуратно слив ее. Промойте клетки тремя миллилитрами PBS и либо сцедите, либо аспирируйте между полосканиями. Пипеткой один миллилитр одного миллиграмма на миллилитр растворенного в PBS красителя люциферового желтого цвета в каждой клеточной пластине.
Предварительно загрузите краситель в клетки, зажав скальпель между указательным и большим пальцами. Поместите скальпель перпендикулярно краю культурной пластины и в пяти миллиметрах от него, а затем под действием силы тяжести позвольте скальпелю мягко скатиться от этого перпендикулярного угла до угла 15 градусов. Прокатите лезвие по популяции клеток в трех разных областях общей пластины.
Далее инкубируйте клетки с раствором LY в течение трех минут при комнатной температуре. Сцедите или аспирируйте LY и промойте клетки, чтобы удалить весь внеклеточный краситель и устранить внеклеточную фоновую флуоресценцию. Затем добавьте 0,5 миллилитра 4% фосфатного буферного раствора формалина для фиксации клеток.
Рассматривайте неподвижные клетки с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с 200-кратным увеличением. Выровняйте все пластины так, чтобы линия отступа была параллельна горизонтальному полю зрения. Была получена серия изображений SL-DT эпителиальных клеток печени крысы WB-F344, обработанных возрастающими дозами фенантрена.
Снижение миграции люциферового желтого флуоресцентного красителя вызвано увеличением доз фенантрена, что свидетельствует о возрастающем индуцированном токсикантами ингибировании межклеточной коммуникации через щелевое соединение, или GJIC. Доля контрольных значений, или значений FOC, полученных из изображений SL-DT, была усреднена, статистически проанализирована, а затем построена график. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как вестерн-блоттинг одиночных трансдукционных белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы.
Например, активируют ли эти соединения митогенные события перфорации клеток?
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод переноса флуоресцентного красителя при помощи скальпеля, который позволяет измерить межклеточную коммуникацию через каналы щелевых контактов. Этот метод представляет собой простой анализ для оценки межклеточного взаимодействия через щелевые контакты в клетках млекопитающих, что имеет решающее значение для понимания тканевого гомеостаза.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Токсикология
Теоретические основы
- Межклеточная коммуникация через щелевые контакты имеет важное значение для поддержания тканевого гомеостаза.
- Нарушение этой связи может привести к неблагоприятным последствиям для здоровья.
- Данный метод позволяет быстро оценить функцию щелевых контактов.
- Он может быть применен в различных фармакологических и токсикологических исследованиях.
Цель исследования
- Для измерения влияния соединений на межклеточную коммуникацию через щелевые контакты.
- Для обеспечения надежного метода оценки развития и поддержания тканей.
- Для содействия исследованиям в области токсикологии, касающимся воздействия токсинов на клеточную коммуникацию.
Используемые методы
- Высейте эпителиальные клетки печени крыс линии WB-F344 на культуральные планшеты.
- Культивируйте клетки до достижения 100% конфлюэнтности.
- Проведите экспериментальную обработку клеток.
- Используйте перенос флуоресцентного красителя для оценки межклеточной коммуникации.
Основные результаты
- Данный метод позволяет оценивать функцию щелевых контактов в больших популяциях клеток.
- Он дает представление о том, как токсиканты влияют на межклеточную коммуникацию.
- Эффективность метода продемонстрирована в различных исследованиях in vitro.
- Быстрый и простой протокол повышает эффективность исследований.
Выводы
- Данный метод является ценным инструментом для токсикологических исследований.
- Он помогает в понимании роли щелевых контактов в поддержании здоровья тканей.
- Будущие исследования могут расширить области его применения в фармакологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Межклеточная коммуникация через щелевые контакты (GJIC) служит функциональным биомаркером для оценки нарушения тканевого гомеостаза под воздействием токсикантов и анализа защитных эффектов природных соединений. Метод переноса флуоресцентного красителя при нагрузке скальпелем (SL-DT) позволяет быстро оценить подавление GJIC на популяционном уровне, что способствует механистическому снижению рисков на ранних этапах поиска новых соединений. Данный анализ обеспечивает прогностическую достоверность при приоритизации соединений на основе их влияния на пути клеточной коммуникации, имеющие критическое значение для функционирования органов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы, связывая воздействие соединения с нарушением GJIC как механизмом токсичности.
- Операционная ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишени путем прямого измерения активности межклеточных каналов в популяциях живых клеток.
- Прогностическая ценность: способствует сортировке портфеля препаратов за счет идентификации ранних биомаркеров неблагоприятного воздействия на поддержание тканей и гомеостаз.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих рабочих процессов путем установления базового уровня функциональности GJIC.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизированных количественных показателей переноса красителя, подходящих для автоматизации и высокопроизводительной визуализации.
- Масштабируемость: Метод адаптирован для срезов тканей in vivo и совместим с автоматической флуоресцентной микроскопией для увеличения пропускной способности анализа образцов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: связывает результаты открытий с доклинической валидацией посредством консервативных механизмов GJIC у разных видов.
- Механистическое снижение рисков: позволяет определить, являются ли наблюдаемые фенотипы следствием нарушения межклеточной коммуникации, а не побочных эффектов.
- Принятие решений с учетом рисков: определяет критерии дальнейшего продвижения за счет количественной оценки взаимосвязи «структура — активность» при модуляции GJIC.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Анализ SL-DT служит инструментом на этапе первичного поиска для получения данных о механизмах действия; он применяется перед этапом оптимизации ведущих соединений для отсева веществ с высоким риском повреждения тканей.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез путем количественной оценки того, как токсиканты или природные соединения изменяют сети межклеточного сигналинга.
- Скрининг: обеспечивает готовность метода анализа за счет воспроизводимых функциональных показателей на уровне популяции клеток, которые отражают взаимодействие на уровне тканей.
- Аналитика: позволяет вычислять значения доли от контроля (FOC) для статистического сравнения различных доз и временных точек.
- Трансляционные исследования: согласуется со стратегиями поиска биомаркеров путем установления связи между функцией GJIC и показателями целостности тканей в доклинических моделях.
- Корпоративное повторное использование: служит универсальной платформой для программ в области токсикологии, фармакологии и разработки нутрицевтиков.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, обеспечивая прямой функциональный анализ активности каналов щелевых контактов.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет простого нанесения образца скальпелем и визуализации с фиксированной конечной точкой.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), связывая раннее нарушение межклеточной коммуникации (GJIC) с последующими неблагоприятными эффектами в тканях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков путем выявления соединений, сохраняющих гомеостаз межклеточной коммуникации.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с культурами клеток, флуоресцентными красителями и эпифлуоресцентной микроскопией.
- Зависит от стандартизированной техники использования скальпеля и соблюдения постоянного времени инкубации для надежного переноса красителя.
- Требуется согласование между исследовательскими группами порогов анализа изображений и морфометрических параметров.
- Метод применим для различных типов клеток млекопитающих и срезов тканей при условии оптимизации параметров загрузки и фиксации.
- Ограничен оценкой функциональной активности каналов; не позволяет разграничить экспрессию коннексинов, их фосфорилирование или состояния гейтинга.
