Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Общая цель этого хромогенного анализа заключается в скрининге различных ферментов в высокопроизводительном формате на основе выбора различных хромогенных субстратов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области открытия ферментов, такие как поиск новых ферментных активностей для деградации биомассы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что хромогенные подложки доступны в четырех различных цветах, что делает этот метод высокопроизводительным, чрезвычайно надежным и экономичным.

Для начала активируйте 96-луночный набор для анализа фильтров, добавив 200 микролитров раствора активации в каждую лунку. Выдерживать при комнатной температуре без перемешивания в течение 10 минут. Для сбора используйте центрифугу и любой стандартный 96-луночный планшет.

Чтобы открутить существующий раствор активации, добавьте 100 микролитров стерильной воды в хромогенный полимерный гидрогель или подложки CPH и примените вакуум или отжим для удаления стабилизатора. Повторите стирку еще два раза. Для приготовления ферментной реакции в каждую лунку планшета набора для анализа добавьте 150 мЛ буфера из 100 мМ ацетата натрия, рН 4,5 и 5 мк раствора эндоцеллюлазы с тремя различными концентрациями.

Поместите пластину с продуктом под пластину пробирного набора, чтобы собрать любую потенциальную утечку из реакционной пластины во время встряхивания. Затем инкубируйте планшет для пробирного набора при комнатной температуре в горизонтальном шейкере при 100 об/мин в течение 30 минут. Для получения достоверных данных необходимо перемешивать реакционную смесь во время инкубации.

Поместите планшет с планшетом для анализа вместе с подлежащей под ним планшетом с продуктом в центрифугу и уменьшите при давлении 2 700 x g в течение 10 минут. Для переноса продукта реакции в углубления продукта производится пластина. После отжима визуально осмотрите пластину с продуктом, чтобы проверить, примерно ли объем жидкости в каждой лунке одинаков.

С помощью планшетного ридера считайте поглощение сборной пластины на длине волны 630 нм для различных зеленых подложек CPH. Анализируйте и отображайте данные в соответствии с текстовым протоколом. Проводить хромогенный анализ с красной нерастворимой хромогенной биомассой или ICB-пшеничной соломой начинают с добавления 200 мкл активационного раствора в каждую лунку пробирной пластины.

Затем выдержите тарелку при комнатной температуре без перемешивания в течение 10 минут. Снимите стабилизатор, используя 100 микролитров стерильной воды, чтобы трижды промыть лунки. Затем добавьте 150 мкл 100 мМ буфера ацетата натрия pH 4,5 и 5 мкл 10 ЕД на миллилитр различного раствора эндо-ксиланазы.

Расположите пластину для продукта под пластиной подложки, чтобы собрать любую потенциальную утечку с пластины подложки во время встряхивания. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре при 100 об/мин в течение двух часов. После инкубации поместите планшет с набором для анализа с планшетом с продуктом под ним в центрифугу и уменьшите его при давлении 2 700 x g на 10 мин для переноса продукта реакции в лунки планшета с продуктом.

Проверьте, чтобы объем жидкости в каждой лунке был примерно одинаковым. Затем с помощью считывателя планшетов считывали поглощение сборной пластины при 517 нм для красной ICB-пшеничной соломы. Проводите анализ данных в соответствии с текстовым протоколом.

Здесь показан пример ответа на дозу CPH-арабиноксилана на ксиланазу при различных концентрациях фермента, где снижение концентрации фермента можно наблюдать визуально. Более детальное спектрофотометрическое количественное определение используется для построения графика зависимости поглощения от концентрации фермента. При этом интенсивность сигнала соответствует активности фермента.

В этом примере анализа, используемого для ферментного скрининга, эндоцеллюлазу тестировали в трех концентрациях против различных субстратов CPH. Как видно на рисунке, активность, дополняющая целлюлазу, проявлялась в отношении CPH-глюкана, CPH-ксилана, CPH-ксилоглюкана, а низкая активность наблюдалась в отношении CPH-галактоманнана. Те же субстраты CPH расщепляли коммерчески доступными ферментами, используемыми в качестве положительного контроля в тех же условиях.

Полученные результаты показывают, что все субстраты деградировали на уровнях, которые увеличивались с увеличением концентрации ферментов. В этом эксперименте пять субстратов ICB были включены с 19 субстратами CPH для анализа секретируемых ферментов Phanerochaete chrysosporium при трех различных условиях pH. Ферменты P.chrysosporium расщепляют различные глюканы, крахмалы и ксиланы.

Более низкие сигналы могут быть обнаружены для гемицеллюлоз арабинана и пектинового галактана, а также для RGI. Полученные ферменты были более активны в кислых условиях, чем в нейтральных или слабощелочных. После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за час, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать перемешивать реакцию во время инкубации. После своего развития этот метод прокладывает путь исследователям в области высокопроизводительного скрининга для изучения новых ферментативных активностей для биотехнологии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как пользоваться комплектом для скрининга.