Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits
20 сентября 2016 г.
Описан высокопроизводительный анализ для скрининга ферментов. Этот мультиплексный готовый к использованию набор для анализа состоит из предварительно отобранных субстратов C,hromogenic P.olymer H,ydrogel (CPH) и сложных субстратов Inрастворимых C,hromogenic Biomass (ICB). Ферментами-мишенями являются полисахариды, разрушающие эндоферменты и протеазы.
Общая цель этого хромогенного анализа заключается в скрининге различных ферментов в высокопроизводительном формате на основе выбора различных хромогенных субстратов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области открытия ферментов, такие как поиск новых ферментных активностей для деградации биомассы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что хромогенные подложки доступны в четырех различных цветах, что делает этот метод высокопроизводительным, чрезвычайно надежным и экономичным.
Для начала активируйте 96-луночный набор для анализа фильтров, добавив 200 микролитров раствора активации в каждую лунку. Выдерживать при комнатной температуре без перемешивания в течение 10 минут. Для сбора используйте центрифугу и любой стандартный 96-луночный планшет.
Чтобы открутить существующий раствор активации, добавьте 100 микролитров стерильной воды в хромогенный полимерный гидрогель или подложки CPH и примените вакуум или отжим для удаления стабилизатора. Повторите стирку еще два раза. Для приготовления ферментной реакции в каждую лунку планшета набора для анализа добавьте 150 мЛ буфера из 100 мМ ацетата натрия, рН 4,5 и 5 мк раствора эндоцеллюлазы с тремя различными концентрациями.
Поместите пластину с продуктом под пластину пробирного набора, чтобы собрать любую потенциальную утечку из реакционной пластины во время встряхивания. Затем инкубируйте планшет для пробирного набора при комнатной температуре в горизонтальном шейкере при 100 об/мин в течение 30 минут. Для получения достоверных данных необходимо перемешивать реакционную смесь во время инкубации.
Поместите планшет с планшетом для анализа вместе с подлежащей под ним планшетом с продуктом в центрифугу и уменьшите при давлении 2 700 x g в течение 10 минут. Для переноса продукта реакции в углубления продукта производится пластина. После отжима визуально осмотрите пластину с продуктом, чтобы проверить, примерно ли объем жидкости в каждой лунке одинаков.
С помощью планшетного ридера считайте поглощение сборной пластины на длине волны 630 нм для различных зеленых подложек CPH. Анализируйте и отображайте данные в соответствии с текстовым протоколом. Проводить хромогенный анализ с красной нерастворимой хромогенной биомассой или ICB-пшеничной соломой начинают с добавления 200 мкл активационного раствора в каждую лунку пробирной пластины.
Затем выдержите тарелку при комнатной температуре без перемешивания в течение 10 минут. Снимите стабилизатор, используя 100 микролитров стерильной воды, чтобы трижды промыть лунки. Затем добавьте 150 мкл 100 мМ буфера ацетата натрия pH 4,5 и 5 мкл 10 ЕД на миллилитр различного раствора эндо-ксиланазы.
Расположите пластину для продукта под пластиной подложки, чтобы собрать любую потенциальную утечку с пластины подложки во время встряхивания. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре при 100 об/мин в течение двух часов. После инкубации поместите планшет с набором для анализа с планшетом с продуктом под ним в центрифугу и уменьшите его при давлении 2 700 x g на 10 мин для переноса продукта реакции в лунки планшета с продуктом.
Проверьте, чтобы объем жидкости в каждой лунке был примерно одинаковым. Затем с помощью считывателя планшетов считывали поглощение сборной пластины при 517 нм для красной ICB-пшеничной соломы. Проводите анализ данных в соответствии с текстовым протоколом.
Здесь показан пример ответа на дозу CPH-арабиноксилана на ксиланазу при различных концентрациях фермента, где снижение концентрации фермента можно наблюдать визуально. Более детальное спектрофотометрическое количественное определение используется для построения графика зависимости поглощения от концентрации фермента. При этом интенсивность сигнала соответствует активности фермента.
В этом примере анализа, используемого для ферментного скрининга, эндоцеллюлазу тестировали в трех концентрациях против различных субстратов CPH. Как видно на рисунке, активность, дополняющая целлюлазу, проявлялась в отношении CPH-глюкана, CPH-ксилана, CPH-ксилоглюкана, а низкая активность наблюдалась в отношении CPH-галактоманнана. Те же субстраты CPH расщепляли коммерчески доступными ферментами, используемыми в качестве положительного контроля в тех же условиях.
Полученные результаты показывают, что все субстраты деградировали на уровнях, которые увеличивались с увеличением концентрации ферментов. В этом эксперименте пять субстратов ICB были включены с 19 субстратами CPH для анализа секретируемых ферментов Phanerochaete chrysosporium при трех различных условиях pH. Ферменты P.chrysosporium расщепляют различные глюканы, крахмалы и ксиланы.
Более низкие сигналы могут быть обнаружены для гемицеллюлоз арабинана и пектинового галактана, а также для RGI. Полученные ферменты были более активны в кислых условиях, чем в нейтральных или слабощелочных. После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за час, если она выполнена правильно.
Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать перемешивать реакцию во время инкубации. После своего развития этот метод прокладывает путь исследователям в области высокопроизводительного скрининга для изучения новых ферментативных активностей для биотехнологии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как пользоваться комплектом для скрининга.
Обзор
В данной статье описывается высокопроизводительный хромогенный анализ для скрининга ферментов с использованием мультиплексных субстратов. Набор для анализа включает субстраты на основе хромогенного полимерного гидрогеля (CPH) и нерастворимой хромогенной биомассы (ICB) для тестирования протеаз и эндоферментов, расщепляющих полисахариды.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Скрининг ферментов
- Биотехнология
- Высокопроизводительные анализы
Теоретические основы
- Поиск новых ферментов имеет решающее значение для различных применений, включая разложение биомассы.
- Хромогенные субстраты позволяют визуально отслеживать активность ферментов.
- Данный анализ разработан так, чтобы быть надежным и экономически эффективным.
- Различные субстраты обеспечивают широкий спектр цветов для более детального анализа.
Цель исследования
- Разработать метод скрининга ферментов с различными субстратами.
- Выявить новые ферментативные активности для деградации биомассы.
- Обеспечить возможность высокопроизводительного скрининга в исследованиях ферментов.
Используемые методы
- Активация планшета набора для фильтрационного анализа с 96 лунками с помощью раствора для активации.
- Инкубация ферментативных реакций в контролируемых условиях.
- Использование центрифуги для сбора продукта.
- Измерение оптической плотности на определенных длинах волн для анализа данных.
Основные результаты
- Активность ферментов наблюдалась для различных субстратов CPH и ICB.
- Более высокие концентрации ферментов приводили к усилению деградации субстрата.
- Различные субстраты демонстрировали разную степень ферментативной активности.
- Кислая среда повышала активность ферментов по сравнению с нейтральной или щелочной средой.
Выводы
- Данный анализ представляет собой надежную платформу для скрининга ферментов.
- Он позволяет исследователям эффективно изучать активность новых ферментов.
- Освоение данной методики позволяет проводить анализ быстро, менее чем за один час.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Высокопроизводительный скрининг ферментов сталкивается с проблемой ограниченности доступных субстратов и масштабируемости анализа, что затрудняет быструю функциональную характеристику углевод-активных ферментов (CAZymes), имеющих решающее значение для применения в биотопливной, текстильной и пищевой промышленности. Данный хромогенный анализ устраняет этот технологический разрыв, обеспечивая возможность мультиплексного тестирования субстратов с цветовым кодированием в 96-луночном формате, что повышает достоверность прогнозов на ранних этапах поиска ферментов и помогает в принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) в процессах ферментной инженерии. Метод улучшает трансляционную преемственность от идентификации мишени до валидации, аналогичной доклинической, предоставляя количественные и воспроизводимые показатели активности для различных полисахаридных субстратов.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает функциональный анализ предполагаемых CAZymes путем установления связи между генетическими кандидатами и биохимической активностью на определенных полисахаридных субстратах.
- Операционная ценность: поддерживает быструю проверку гипотез с помощью цвето-мультиплексных субстратов CPH, что увеличивает пропускную способность скрининга без ущерба для достоверности данных.
- Прогностическая ценность: облегчает снижение механистических рисков за счет количественного определения дозозависимой активности ферментов, что помогает в приоритизации мишеней для разработки промышленных ферментов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Предоставляет стандартизированные нерастворимые хромогенные субстраты (CPH и ICB), имитирующие сложную биомассу, что позволяет проводить физиологически релевантную оценку активности.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость анализа за счет стандартизированных этапов активации, промывки и центрифугирования, что снижает вариабельность в высокопроизводительных рабочих процессах.
- Ценность масштабирования: Совместимость со стандартными планшетными ридерами на 96 лунок и системами дозирования жидкостей позволяет интегрировать метод в существующие платформы скрининга для оценки ферментных коктейлей или бульонов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Оказывает поддержку моделированию систем, имеющих значение для заболеваний, путем тестирования активности ферментов при различных значениях pH, что отражает условия промышленных технологических процессов.
- Операционная ценность: Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем развитии, сопоставляя концентрацию фермента со степенью деградации субстрата для различных типов биомассы (например, пшеничной соломы, глюканов, ксиланов).
- Прогностическая ценность: Улучшает согласованность трансляционных биомаркеров путем выявления pH-зависимых паттернов активности, которые имеют решающее значение для стабильности рецептур при применении в производстве моющих средств или биотоплива.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ соответствует этапу от раннего поиска до идентификации лидирующих соединений, обеспечивая проверку гипотез, уточнение путей метаболизма и снижение биологических рисков для ферментов, расщепляющих углеводы, перед инвестициями в белковую инженерию или масштабирование ферментации.
- Биология открытий: позволяет уточнить биохимические пути путем скрининга активности ферментов в отношении специфических полисахаридных субстратов (например, CPH-глюкана, CPH-ксилана) для определения субстратной специфичности и функциональной роли.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и получение количественных данных посредством измерения абсорбции при 630 nm (CPH) и 517 nm (ICB), что позволяет проводить надежное сравнение вариантов ферментов или условий.
- Аналитика: предоставляет данные зависимости «доза-ответ», которые используются для статистического анализа и отбора хитов, помогая группам исследователей ранжировать кандидаты в ферменты по активности и специфичности.
- Трансляционные исследования: связывают этап открытий с доклинической преемственностью путем оценки работы ферментов в промышленно значимых условиях (например, при кислотном pH, на сложных биомассных субстратах).
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемая платформа для скрининга библиотек ферментов, культуральных сред или коктейлей в рамках нескольких проектов в биоиндустрии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения количества ложноположительных результатов благодаря прямому измерению активности на нерастворимых субстратах, близких к нативным.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет четко определенных объемов реагентов, времени инкубации и параметров центрифугирования, что минимизирует вариабельность, зависящую от пользователя.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя проводить быстрый скрининг сотен кандидатов в ферменты, что сокращает время и затраты, связанные с низкопроизводительными биохимическими анализами.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков, предоставляя количественные данные об активности, которые служат основанием для принятия решений о продолжении или прекращении работ в рамках кампаний по инженерии ферментов.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области кинетики ферментов и оптимизации хромогенного анализа для обеспечения точного приготовления субстрата и мониторинга реакции.
- Необходим доступ к планшетному ридеру, способному измерять абсорбцию при 630 nm и 517 nm, а также к центрифуге, совместимой с 96-луночными планшетами, для переноса продукта.
- Необходима межкомандная стандартизация условий буфера (например, ацетат натрия pH 4.5) и параметров инкубации (например, встряхивание при 100 rpm) для обеспечения воспроизводимости результатов в разных центрах.
- При тестировании неполисахаридных субстратов следует учитывать необходимость адаптации, так как данный анализ оптимизирован для углевод-активных ферментов и может потребовать модификации буфера или субстрата для других классов ферментов.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость избегать перемешивания на этапах активации и стабилизации, а также визуальное подтверждение равного объема продукта после центрифугирования для надежной интерпретации данных.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Chromogenic Assay with CPH Substrates, Detection, and Quantification
2:41
Chromogenic Assay with Insoluble Chromogenic Biomass Substrates, Detection, and Quantification
4:15
Results: Enzymatic Degradation of Chromogenic Polymer Hydrogel Substrates
6:02
Conclusion
