Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции

Общая цель метода FINA (filtration isolation of nucleic acids — фильтрационная изоляция нуклеиновых кислот) заключается в быстром и простом выделении геномной ДНК из сложных образцов для ПЦР-амплификации без использования лабораторного оборудования, такого как центрифуга. Этот экспресс-метод экстракции ДНК на бумажной основе для выделения провирусной ДНК ВИЧ был разработан для интеграции в диагностическое устройство для количественной ПЦР. Основным преимуществом данной методики является возможность предварительной подготовки модулей подготовки проб и ПЦР-пробирок, благодаря чему процесс экстракции ДНК занимает менее двух минут.

Первоначально мы разработали этот метод для включения в состав анализа для ранней диагностики ВИЧ-1 у младенцев по крови из пятки. Как правило, лица, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как удаление защитного слоя двусторонней ленты, которая фиксирует мембрану для захвата клеток на стенке ПЦР-пробирки, требует определенной сноровки. Процедуру продемонстрирует Джен Рид, старший техник моей лаборатории.

Начните выполнение данной процедуры с подготовки материалов, необходимых для сборки модуля подготовки образцов FINA. Подготовьте thấmную прокладку, вырезав квадрат размером 35 на 35 миллиметров из 100% хлопковой прокладки толщиной 2.6 миллиметров. Подготовьте пластиковую парафиновую пленку с бумажной подложкой.

Отрежьте кусок парафиновой пленки размером 25 на 50 мм, затем с помощью молотка пробейте в центре пленки отверстие диаметром 7.14 mm. Подготовьте связанную стеклянную мембрану-сепаратор крови или диск для захвата, выбив молотком круг диаметром 8.35 mm. Для сборки модуля подготовки проб FINA с помощью пинцета поместите диск для захвата в центр фильтровального pad.

Снимите защитную подложку с парафиновой пленки и наложите ее на диск для захвата таким образом, чтобы центр диска оставался открытым. Для обеспечения максимального контакта между диском и фильтровальной подложкой слегка растяните парафиновую пленку, чтобы она закрыла фильтровальную подложку, и плотно прижмите пленку, чтобы зафиксировать ее по всем краям диска. Для крепления мембраны захвата к стенке пробирки для qPCR требуется диск из пленки диаметром 5,1 mm, чтобы мембрана не блокировала детектирование флуоресценции в приборе для ПЦР в реальном времени.

Подготовьте этот диск из ленты, используя молоток, чтобы выбить круг из диагностической полиэфирной ленты с двойным покрытием из листа этой ленты. С помощью пинцета удалите одну сторону защитной подложки клейкой ленты. Поместите ленту в ПЦР-пробирку объемом 200 µL, приклеив ее к одной из стенок ближе к дну пробирки.

Удалите вторую подложку наклейки. Теперь пробирка готова к помещению в нее подготовленного диска. В данном видео будет продемонстрировано обнаружение провирусной ДНК в цельной крови с добавлением 8e5 клеток LAV.

Разморозьте предварительно замороженные пеллеты клеток LAV в количестве 8e5 на льду. Подготовьте серийные разведения клеток в среде для замораживания с концентрацией от 1 до 400 клеток на микронлитр. Перенесите пипеткой по 10 микронлитров клеток из каждого разведения в микроцентрифужную пробирку.

Для построения стандартной кривой добавьте в каждую пробирку по 100 µL свежей образца цельной крови, обработанной eDTA и отрицательной по ВИЧ-1. Перемешайте, осторожно постучав по дну пробирки пять раз. Чтобы начать процедуру экстракции ДНК, лизируйте клетки крови, добавив triton X-100 до конечной концентрации 1%.

Перемешайте содержимое, осторожно постучав по дну пробирки пять раз. Кровь должна приобрести полупрозрачный красный цвет. Перенесите весь образец крови пипеткой на захватный диск.

Герметичное соединение между парафиновой лентой и мембраной для захвата гарантирует прохождение крови через мембрану. А плотный контакт между мембраной и блоком абсорбирующих прокладок обеспечивает быстрое впитывание образца. Дайте образцу полностью пропитать фильтр.

Лизат крови впитался в захватывающий диск, и поверхность диска стала матовой. Покапельно добавьте от 600 до 1 000 µL 10 mmol гидроксида натрия на захватывающий диск. Фильтр изменит цвет с красного на белый, что свидетельствует об удалении гемоглобина.

Затем отделите диск от фильтровальной бумаги и приложите его к ленте в подготовленной ПЦР-пробирке. После помещения фильтра в ПЦР-пробирку немедленно приступите к анализу образца. Приготовьте мастер-микс для qPCR согласно описанию в тексте протокола; убедитесь, что фильтр полностью покрыт мастер-миксом и остается зафиксированным у стенки пробирки на протяжении всей реакции.

Проведите амплификацию с помощью прибора для ПЦР в реальном времени, как описано в тексте протокола. Если выполнение qPCR сразу невозможно, высушите фильтр в течение ночи в контейнере с осушителем на основе сульфата кальция. На следующий день закройте ПЦР-пробирку крышкой, поместите ее в фольгированный пакет с силикагелем и храните при комнатной температуре до начала анализа.

Данный метод позволяет эффективно проводить амплификацию провируса ВИЧ-1 из 8e5 клеток LAV с различным числом копий. Сплошные линии представляют собой кривые амплификации, полученные из четырех повторностей цельной крови, отрицательной по ВИЧ-1, в которую были добавлены 4 000, 400, 40 и 10 клеток 8e5 LAV, при наличии 500 копий внутреннего контроля на реакцию. Пунктирная линия обозначает порог.

На следующем графике представлены стандартные кривые значений цикла квантификации, рассчитанные на основе графика амплификации, в зависимости от логарифма числа копий 8e5 клеток LAV на 100 µL цельной крови. Рассчитанная эффективность ПЦР составила 103%. Повторности стандартной кривой провирусной ДНК ВИЧ также демонстрируют высокую воспроизводимость амплификации.

Кроме того, наличие внутреннего контроля в виде 500 копий гидроксипируватредуктазы показывает, что при использовании данного метода экстракции крови ингибирование ПЦР не происходит, независимо от количества копий провируса HIV-1. Сплошные линии представляют собой графики амплификации, а пунктирная линия — порог. После выполнения этой процедуры мишени ПЦР могут быть амплифицированы из различных типов образцов для обнаружения интересующего вас гена.

Например, мазки из полости рта для фармакогенетического скрининга или кровь для быстрого генотипирования животных моделей. Не забывайте, что работа с патогенами, передающимися через кровь, может быть крайне опасной, и при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать универсальные меры предосторожности.