Комбинированный ближней инфракрасной области флуоресцентных изображений и микро-компьютерной томографии для прямого Визуализируя церебральный тромбоэмболию

Общая цель данного метода прямой визуализации тромбов заключается в количественной визуализации флуоресцентно-меченых церебральных тромбоэмболов in vivo и ex vivo с использованием наночастиц золота, компьютерной томографии и ближней инфракрасной флуоресцентной визуализации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гемостаза и тромбоза, такие как зависимость от времени или дозы, а также выраженность терапевтического ответа церебральных тромбоэмболов на тканевый активатор плазминогена или новые исследуемые тромболитические средства. Основным преимуществом данной методики является то, что после внутривенного введения наночастиц золота микро-КТ высокого разрешения позволяет регистрировать динамику развития церебральных тромбоэмболов путем количественной визуализации их локализации и объема in vivo с последующим подтверждением с помощью ближней инфракрасной флуоресцентной визуализации тромбов ex vivo.

Процедуру продемонстрирует Чжон-Йон Ким, постдок из моей лаборатории. После сбора от 300 до 1 000 µL артериальной крови путем пункции сердца добавьте 70 µL образца к 30 µL соответствующего активированного коагуляционного фактора и флуоресцентного зонда, чувствительного к активности фибринового сшивания, опосредованного фактором XIII, затем наберите полученную смесь в шприц объемом 3 мл, оснащенный иглой 23G. Далее введите маркированную кровь в полиэтиленовую трубку длиной 20 см и оставьте кровь для свертывания при комнатной температуре.

Через два часа перенесите пробирку при температуре 4 °C на 22 часа, затем разрежьте ее на фрагменты длиной 1,5 см. С помощью шприца объемом 3 мл, заполненного PBS, вытолкните тромб из каждого фрагмента трубки в отдельные лунки шестилуночного планшета, содержащего PBS. Промойте тромбы трижды с помощью PBS, затем введите шприц объемом 1 мл, заполненный физраствором и оснащенный иглой 30G, в один конец трубки PE10 длиной 15 см и осторожно втяните один промытый тромб в противоположный конец трубки.

Затем соедините трубку PE10, содержащую тромб, с трубкой PE50 длиной три сантиметра с конусообразным концом диаметром 200 микрон. После подтверждения анестезии по отсутствию реакции на щипок за палец лапы продезинфицируйте операционное поле раствором Betadine и 70% алкоголем, затем с помощью скальпеля сделайте вертикальный разрез длиной один сантиметр между левым ухом и глазом. Приклейте дистальный конец оптического волокна лазерного допплеровского флоуметра к обнаженной поверхности левой височной кости в одной миллиметре левее и в четырех миллиметрах ниже брегмы и начните допплеровский мониторинг.

Затем сделайте вертикальный срединный разрез длиной три сантиметра через периваскулярные мягкие ткани, чтобы обнажить область левого каротидного синуса. С помощью стерильной черной шелковой нити 6-0 перевяжите левую проксимальную общую сонную артерию, затем перевяжите левую внутреннюю сонную артерию и левую крылонебную артерию стерильными черными шелковыми нитями 7-0. С помощью монополярного электрокоагулятора прижгите левую верхнюю щитовидную артерию, после чего с помощью стерильных черных шелковых нитей 7-0 наложите свободную лигатуру на левую проксимальную наружную сонную артерию и плотную лигатуру на дистальный конец сосуда.

С помощью микроножниц сделайте отверстие размером от 0,2 до 0,25 мкм между местами лигирования наружной сонной артерии и вставьте в это отверстие катетер с тромбом, одновременно ослабляя проксимальное лигирование наружной сонной артерии. Продвиньте катетер в общую сонную артерию, чтобы зафиксировать его на месте, и снова затяните проксимальное лигирование наружной сонной артерии. Пересеките дистальный конец наружной сонной артерии с помощью коагуляции и поверните свободный проксимальный конец наружной сонной артерии по часовой стрелке, чтобы совместить сосуд с внутренней сонной артерией, извлекая при этом катетер.

Затем ослабьте лигатуру внутренней сонной артерии и немедленно введите катетер примерно на девять миллиметров до бифуркации средней и передней мозговых артерий. Теперь снова затяните шов внутренней сонной артерии вокруг катетера и плавно нажмите на шприц, чтобы ввести тромб в область бифуркации. Если по данным Допплера наблюдается кровоток, который превышает или равен 30% от базового уровня (т. е. снижение менее чем на 30%), извлеките катетер и немедленно перевяжите проксимальный конец наружной сонной артерии.

Для визуализации тромба с помощью микрокомпьютерной томографии в соответствующий временной точке эксперимента разведите нацеленные на фибрин золотые наночастицы до концентрации 10 mg/mL в 10 mM PBS и подвергните агент для визуализации тромба воздействию ультразвука в течение 30 минут, чтобы обеспечить гомогенность суспензии наночастиц. Затем введите 300 µL нацеленных на фибрин частиц в пенильную вену экспериментального животного. Переместите животное на ложе микро-КТ сканера и с помощью привязанной к штифту нити осторожно потяните за верхние передние зубы, чтобы выпрямить шею.

Начните визуализацию через пять минут после введения наночастиц золота. Для визуализации тромба с помощью экс-виво ближнего инфракрасного излучения поместите иссеченную ткань мозга в сканер основанием вверх. Получите изображения флуоресцентно помеченных тромбоэмболов в артериях виллизиева круга.

Затем расположите ткань вершиной вверх и визуализируйте корковые тромбоэмболы. Увлажните ткань несколькими каплями физиологического раствора, после чего, используя устройство для матричного секционирования мозга согласно инструкциям производителя, быстро сделайте шесть корональных срезов мозга толщиной 2 мм. Поддерживая увлажнение срезов физиологическим раствором, сделайте дополнительные изображения передней и задней поверхностей секций в ближнем инфракрасном диапазоне.

Для количественного определения площади тромба после микро-КТ визуализации откройте файлы с последовательностью изображений и выберите Image, затем Type, затем 8-bit, чтобы преобразовать изображения в 8-битный градиент серого. Если один пиксель файлов КТ-изображений соответствует 0,053 мм, используйте Analyze Set Scale, чтобы ввести 1, 0,053 и millimeters для Distance in pixels, Known distance и Unit of length соответственно. Затем в меню Edit выберите Selection, а затем Specify, чтобы разместить область интереса на участке паренхимы головного мозга, где отсутствует тромб или гиперденсная область, связанная с костью.

Поскольку выбранная область интереса применяется к каждому срезу стека, убедитесь, что эта область не перекрывается с гиперденсными участками ни на одном из срезов. Затем в меню Plugin выберите Region of Interest и Background Subtraction из раздела Region of Interest и введите значение 2 для параметра Number of standard deviations from the mean. Найдите гиперденсные очаги, связанные с тромбоэмболией, и увеличьте масштаб изображения в области поражения.

Теперь выберите Image (Изображение), затем Adjust (Настройка) и Threshold (Порог), после чего установите значение Lower Threshold Level (Нижний порог) на 22 и Upper Threshold Level (Верхний порог) на 255. Выберите Over/Under, чтобы отобразить пиксели ниже значения нижнего порога синим цветом, пиксели в пределах порога — оттенками серого, а пиксели выше значения верхнего порога — зеленым цветом. Затем с помощью инструмента Freehand (Свободное выделение) обведите области интереса, охватывающие гиперденсные очаги, связанные с тромбоэмболией, избегая захвата костных структур.

Используйте Analyze, Set Measurements, чтобы выбрать Area, Mean gray value и Integrated density area times mean. Отметьте следующие опции: Limit to threshold и Display label. Используйте Analyze Measure для получения количественных данных, затем сохраните результаты.

Эти исходные микро-КТ изображения были получены in vivo через пять минут после инъекции нацеленных на фибрин золотых наночастиц спустя один час после эмболического инсульта у мышей. Церебральный тромб четко визуализируется в области бифуркации средней и передней мозговых артерий дистального отдела внутренней сонной артерии. Последующие микро-КТ снимки не демонстрируют изменений тромба в круге Виллиса у животных, получавших физиологический раствор; однако у животных, получавших тканевый активатор плазминогена, наблюдается постепенное растворение тромба в круге Виллиса с течением времени, на что указывают синие стрелки.

Наблюдается сильная корреляция между плотностью КТ in vivo и данными ближнего инфракрасного имиджинга ex vivo для оценки остаточных тромбоэмболов через 24 часа. Например, на этих изображениях гиперденсные области микро-КТ, визуализированные с помощью золотых частиц, нацеленных на фибрин, напрямую соответствуют областям ближнего инфракрасного сигнала, выявленным с помощью флуоресцентного зонда, чувствительного к активности сшивания фибрина, опосредованной фактором коагуляции 13A, который связывается с тромбом в процессе созревания предварительно сформированного сгустка. Кроме того, как показано на этих изображениях, окрашивание ТТС может быть использовано для оценки эффектов тромболизиса при ишемическом повреждении головного мозга в группе контроля (физиологический раствор) по сравнению с животными, получавшими тканевый активатор плазминогена.

После освоения данная методика микро-КТ визуализации in vivo и флуоресцентной визуализации тромбоза в ближнем инфракрасном диапазоне ex vivo может быть выполнена примерно за один час при условии правильного проведения процедуры и наличия необходимых зондов для визуализации. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использования неагрегированных золотых наночастиц, нацеленных на фибрин, для прямой микро-КТ визуализации церебрального тромбоза. После завершения данной процедуры для ответа на дополнительные вопросы, такие как распределение в тканях и кинетика золотых наночастиц в крови, могут быть применены другие методы, например, электронная микроскопия или ICP-MS (масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой).

После разработки эта методика позволила исследователям в области инсультов и сердечно-сосудистых заболеваний изучать тромбоэмболию на животных моделях, восприимчивых к коронарному тромбозу или эмболическим церебральным инфарктам. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать флуоресцентно меченные тромбы для моделирования тромбоэмболического инсульта у мышей, а также проводить серийную визуализацию и количественную оценку церебральных тромбоэмболов in vivo и ex vivo, отслеживая тем самым эволюцию тромба.