Роботизированной платформы для высокой пропускной способности выделения протопластов и трансформации

Общая цель этого протокола заключается в разработке метода быстрого, автоматизированного высокопроизводительного скрининга растительных протопластов, в частности, для устранения текущего узкого места в раннем скрининге большого количества целей редактирования генома и подавления экспрессии генов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биотехнологии растений. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает высокопроизводительное автоматизированное производство и трансформацию протопластов для быстрого параллельного скрининга функции промотора в экспрессии генов.

Эта процедура будет продемонстрирована на примере широко используемой культуры суспензии табака ярко-желтого цвета, или BY-2. Начните с выращивания культуры BY-2 в колбе Эрленмейера, как описано в тексте протокола. В день выделения протопластов тщательно перемешайте культуру, так как клетки быстро осядут, и перенесите шесть миллилитров культуры в 15-миллилитровую центрифужную пробирку с коническим дном.

Дайте клеткам отстояться не менее 10 минут. Отрегулируйте объем упакованной ячейки до 50% от общего объема, удалив соответствующий объем надосадочной жидкости. Встряхните пробирку, перевернув ее, а затем с помощью пипеток с широким отверстием внесите 500 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку шестилуночного планшета для разложения.

Первым шагом в этой процедуре является включение всех компонентов робототехнической системы, которыми являются движитель микропластин, манипулятор жидкости, многорежимный считыватель пластин, многорежимный диспенсер, нагреватель или чиллер пластин, а также компьютеры. Затем откройте программное обеспечение для планирования задач platemover, которое интегрирует микроплатформенный движитель с другим оборудованием для обеспечения переноса пластин между каждой единицей оборудования. В программном обеспечении для перемещения пластин определите технические характеристики лабораторного оборудования, используемого в протоколе.

Нажмите «Настройка» на главной панели инструментов и выберите команду «Управление типами контейнеров». Выберите подходящий тип контейнера из списка существующих типов контейнеров. Определите технические характеристики всей лабораторной посуды, с которой столкнется машинист.

Следующим шагом является определение начальной и конечной позиций для каждого контейнера. Перейдите на вкладку Начало/Конец в определенном протоколе. Выберите начальную позицию каждого контейнера и установите флажки «Закрыто», «Без крышки» в начальной и конечной позициях.

После определения начальной и конечной позиций для каждой единицы лабораторной посуды вручную загрузите все пластины в начальную позицию для всего рабочего процесса. Загрузите 96-луночные флуоресцентные экранирующие планшеты в отель два, шестилуночные планшеты с ячейками BY-2 в отель три, планшет глубиной 96 лунок, который будет использоваться для трансформации на гнездо два нагревателя или чиллера, и 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую раствор фермента, на многорежимный дозатор. Чтобы провести трансформацию в протоколе, предварительно загрузите каждую лунку планшета глубиной 96 лунок 10 микролитрами плазменной ДНК, содержащей оранжевую конструкцию флуоресцентного белка, и инкубируйте на нагревателе или охладителе планшета при температуре четыре градуса Цельсия.

Загрузите все расходные материалы и планшеты на автоматизированную платформу для работы с жидкостями в отведенных местах. Загрузите 96-луночный планшет с предварительно загруженным 200 микролитрами 40% раствора полиэтиленгликоля на лунку в первой колонне. Загрузите коробку с наконечниками для пипетки в гнездо восемь.

Чтобы определить местоположение каждого элемента в программном обеспечении автоматизированных платформ для работы с жидкостями, выберите в меню пункт «Инструменты» и нажмите «Редактор лабораторного посуды». Выберите тип лабораторной посуды в раскрывающемся меню. Выберите вкладку «Основной протокол» и нажмите «Настроить лабораторное оборудование», чтобы определить положение каждого лабораторного оборудования.

Нажмите кнопку Выполнить, чтобы инициализировать все устройства, которые будут использоваться в протоколе. Наконец, в окне Work Explorer нажмите кнопку Add Work Unit, чтобы проверить все лабораторное оборудование в системе и запустить автоматический протокол. Наиболее чувствительной частью процедуры является преобразование протопластов.

Поскольку преобразование выполняется робототехнической системой, критически важно, чтобы автоматизированные протоколы были настроены правильно. В этом видео будут показаны только выбранные шаги в автоматизированных протоколах. Во время протокола трансформации автоматизированная платформа для обработки жидкостей отбирает 70 микролитров раствора протопласта из шестилуночной пластины и распределяет его в 96-луночную пластину в гнезде с глубиной 6.

Затем с помощью новых наконечников для пипеток медленно отсасывают 70 микролитров высоковязкого раствора полиэтиленгликоля из предварительно загруженной глубинной луночной пластины и полностью дозируют раствор в соответствующие лунки глубинной луночной пластины. Затем автоматизированная платформа для работы с жидкостями перемещает глубинную скважинную пластину со следующей шестой на девятую, где вибромашина поднимает пластину и перемещает ее на станцию встряхивания пластин и встряхивает ее со скоростью 1500 об/мин в течение 30 секунд. После 20-минутной инкубации без встряхивания для обеспечения балансировки протопластов пластинчатый движитель перемещает луночный планшет глубиной 96 лунок к многорежимному дозатору и запускает протокол промывки.

Когда протокол автоматической изоляции и трансформации протопластов будет завершен, снимите пластину с преобразованными протопластами из одной из робототехнических систем. Включите инвертированный микроскоп, фотоаппарат и люминесцентную лампу. Выберите объектив 10X для первоначальной фокусировки на протопластах.

Включите галогенную лампу и закройте затвор люминесцентной лампы. Загрузите пластину в систему микроскопа и сфокусируйтесь на протопластах с помощью светлого поля. Далее выключите галогенную лампу и откройте затвор люминесцентной лампы.

Выберите набор фильтров Cy3/TRITC для визуализации оранжевого флуоресцентного белка, экспрессируемого трансгенными протопластами. Просканируйте каждую лунку, чтобы определить количество протопластов, экспрессирующих флуоресцентный маркер. Ферментное расщепление протопластов в условиях, указанных в этом протоколе, привело к получению 2 820 000 протопластов на шестилуночный планшет.

Оценивалась потеря концентрации протопластов после каждого этапа переноса в протоколе. После протокола разложения 11 500 протопластов были переведены в каждую лунку из 96-луночных планшетов. После того, как протокол трансформации был завершен, 1230 протопластов были перенесены на 96-луночный флуоресцентный экранирующий планшет.

Чтобы убедиться в том, что несколько стадий пипетирования не повреждают протопласты, их жизнеспособность оценивали с помощью окрашивания йодидом пропидия. Результаты не показали существенной разницы в жизнеспособности после разложения, после переноса на 96-луночный флуоресцентный скрининговый планшет и после протокола трансформации. Протокол трансформации был успешным в создании трансгенных клеток, экспрессирующих оранжевый флуоресцентный белок, хотя эффективность трансформации была низкой, всего около 2%.

Метрики, полученные за время работы с протоколом, показали, что основные затраты времени тратятся на этапе Digestion. Полная продолжительность выделения и преобразования протопластов составила три часа, 50 минут и 53 секунды без необходимости внешнего вмешательства со стороны оператора. После правильной настройки эта техника может быть выполнена роботом менее чем за четыре часа.

После своего развития этот метод открывает путь для исследователей в области биотехнологии растений к выполнению высокопроизводительных геномных процедур сельскохозяйственных культур, таких как редактирование генома и скрининг промоторов.