Роботизированной платформы для высокой пропускной способности выделения протопластов и трансформации

Общая цель данного протокола заключается в разработке метода быстрого автоматизированного высокопроизводительного скрининга протопластов растений, в частности, для устранения существующего затруднения при первичном скрининге большого количества мишеней для редактирования генома и сайленсинга генов. Этот метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области биотехнологии растений. Основным преимуществом данной методики является обеспечение высокопроизводительного автоматизированного получения и трансформации протопластов для быстрого параллельного скрининга функции промоторов в экспрессии генов.

Данная процедура будет продемонстрирована на примере широко используемой суспензионной культуры табака сорта Bright Yellow 2 (BY-2). Начните с выращивания культуры BY-2 в колбе Эрленмейера, как описано в тексте протокола. В день выделения протопластов тщательно перемешайте культуру, так как клетки быстро оседают, и перенесите 6 мл культуры в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл.

Дайте клеткам осесть в течение не менее 10 минут. Доведите объем осадка клеток до 50% от общего объема, удалив соответствующий объем супернатанта. Перемешайте содержимое пробирки путем инверсии, затем с помощью ширококанальных пипеток перенесите по 500 µL клеточной суспензии в каждую лунку шестилуночного планшета для проведения дигестии.

Первым шагом данной процедуры является включение всех компонентов робототехнической системы: переместителя микропланшетов, станции распределения жидкостей, многофункционального планшетного ридера, многоканального диспенсера, нагревателя или охладителя планшетов, а также компьютеров. Затем откройте программное обеспечение для планирования задач переместителя планшетов, которое интегрирует переместитель микропланшетов с остальным оборудованием для обеспечения переноса планшетов между отдельными приборами. В программном обеспечении переместителя планшетов задайте технические характеристики лабораторной посуды, используемой в протоколе.

Нажмите «Setup» на главной панели инструментов и выберите команду «Manage Container Types». Выберите соответствующий тип контейнера (Container Type) из списка существующих типов контейнеров. Определите технические характеристики для всей лабораторной посуды, с которой будет взаимодействовать переместитель планшетов.

Следующий шаг заключается в определении начального и конечного положений для каждого контейнера. Перейдите на вкладку Start/End в конкретном протоколе. Выберите начальное положение каждого контейнера и отметьте галочкой вариант Lidded или Unlidded (с крышкой или без крышки) как для начального, так и для конечного положений.

После определения начального и конечного положений для каждого лабораторного изделия вручную поместите все планшеты в стартовую позицию для всего рабочего процесса. Поместите 96-луночные планшеты для флуоресцентного скрининга в «отель» два, 6-луночные планшеты с клетками BY-2 в «отель» три, 96-луночный планшет с глубокими лунками, который будет использоваться для трансформации, на гнездо два нагревателя или охладителя планшетов, а коническую пробирку объемом 50 мл с раствором фермента — в многорежимный диспенсер. Для проведения трансформации в рамках протокола предварительно внесите в каждую лунку 96-луночного планшета с глубокими лунками по 10 µL плазмидной ДНК, содержащей репортерную конструкцию оранжевого флуоресцентного белка, и инкубируйте на нагревателе или охладителе планшетов при температуре 4 °C.

Разместите все расходные материалы и планшеты на автоматизированной платформе для работы с жидкостями в предназначенных для этого местах. Установите 96-луночный планшет, в лунки первого столбца которого предварительно внесено по 200 µL 40% раствора полиэтиленгликоля. Установите коробку с наконечниками для дозатора в восьмой слот.

Чтобы определить местоположение каждого элемента в программном обеспечении автоматизированной платформы для работы с жидкостями, выберите Tools в меню и нажмите Labware Editor. Выберите тип лабораторной посуды из выпадающего списка. Перейдите на вкладку Main Protocol и нажмите Configure Labware, чтобы определить положение каждого элемента лабораторной посуды.

Нажмите Run, чтобы инициализировать все устройства, которые будут использоваться в протоколе. В завершение в окне Work Explorer нажмите Add Work Unit, чтобы проверить всю лабораторную оснастку в системе и запустить автоматизированный протокол. Наиболее критическим этапом процедуры является трансформация протопластов.

Поскольку трансформация осуществляется робототехнической системой, крайне важно правильно настроить автоматизированные протоколы. В данном видео будут показаны только отдельные этапы автоматизированных протоколов. В ходе протокола трансформации автоматизированная платформа для работы с жидкостями аспирирует 70 µL раствора протопластов из планшета на шесть лунок и переносит его в 96-луночный глубокий планшет в гнезде шесть.

Затем с помощью новых наконечников для пипеток медленно аспирируют 70 microliters высоковязкого раствора полиэтиленгликоля из предварительно заполненного планшета с глубокими лунками и полностью распределяют раствор по соответствующим лункам планшета с глубокими лунками. Далее автоматизированная станция для работы с жидкостями перемещает планшет с глубокими лунками из гнезда шесть в гнездо девять, где манипулятор захватывает планшет, перемещает его на станцию шейкера и встряхивает при 1500 RPM в течение 30 seconds. После 20 minute инкубации без встряхивания для уравновешивания протопластов манипулятор перемещает 96-луночный планшет с глубокими лунками к мультимодальному диспенсеру и запускает протокол промывки.

По завершении автоматизированного протокола выделения и трансформации протопластов извлеките планшет с трансформированными протопластами из первого модуля-инкубатора (hotel one) роботизированной системы. Включите инвертированный микроскоп, камеру и флуоресцентную лампу. Для первоначальной фокусировки на протопластах выберите объектив 10X.

Включите галогеновую лампу и закройте затвор флуоресцентной лампы. Установите планшет в систему микроскопа и с помощью светлого поля сфокусируйтесь на протопластах. Затем выключите галогеновую лампу и откройте затвор флуоресцентной лампы.

Выберите набор фильтров Cy3/TRITC для визуализации оранжевого флуоресцентного белка, экспрессируемого трансгенными протопластами. Просканируйте каждую лунку, чтобы определить количество протопластов, экспрессирующих флуоресцентный маркер. Ферментативное переваривание протопластов в условиях, указанных в данном протоколе, позволило получить 2 820 000 протопластов на одну планшетку с шестью лунками.

Была проведена оценка потери концентрации протопластов после каждого этапа переноса в протоколе. После завершения протокола переваривания в каждую лунку 96-луночного глубокого планшета было перенесено 11 500 протопластов. По завершении протокола трансформации на 96-луночный планшет для флуоресцентного скрининга было перенесено 1 230 протопластов.

Чтобы убедиться, что многократное пипетирование не повредило протопласты, их жизнеспособность оценивали с помощью окрашивания пропидиум иодидом. Результаты не выявили значимых различий в жизнеспособности после переваривания, после переноса в 96-луночный планшет для флуоресцентного скрининга и после протокола трансформации. Протокол трансформации позволил успешно получить трансгенные клетки, экспрессирующие оранжевый флуоресцентный белок, хотя эффективность трансформации была низкой — всего около 2%. Это обусловлено использованием крупного бинарного плазмида и тем, что протокол не был специально оптимизирован для протопластов BY-2.

Показатели, полученные для временного графика протокола, показали, что основная часть времени затрачивается на этапе переваривания. Полная продолжительность изоляции и трансформации протопластов составила три часа 50 минут и 53 секунды, при этом внешнего вмешательства оператора не потребовалось. После надлежащей настройки данный метод может быть выполнен роботом менее чем за четыре часа.

После своей разработки эта методика открывает перед исследователями в области биотехнологии растений путь к проведению высокопроизводительных геномных процедур для сельскохозяйственных культур, таких как редактирование генома и скрининг промоторов.