Измерение In Vitro АТФазы для ферментативного определения характеристик

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке активности АТФазы очищенных белков in vitro для функциональной характеристики. Этот метод может быть использован для характеристики новых предполагаемых АТФаз, оценки эффективных потенциальных активаторов или ингибиторов и определения вклада конкретных доменов или остатков в активность АТФазы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она является простым, чувствительным методом измерения активности АТФазы in vitro и может быть легко оптимизирована.

Подготовьте запасы всех необходимых реагентов для инкубации с очищенным белком, как указано в текстовом протоколе. Предварительно смешайте 100 миллимоляров хлорида магния и 100 миллимолярных АТФ в соотношении один к одному непосредственно перед началом реакции гидролиза АТФ. Подготовьте и промаркируйте пробирки объемом 1,5 миллилитра для сбора образцов через равные промежутки времени на протяжении всей реакции.

Подготовьте пробирки для сбора образцов в нулевое время, а также в течение 15, 30, 45 и 60 минут. Добавьте 245 микролитров 1x HNG буфера в каждую пробирку, чтобы разбавить образцы, собранные в реакциях гидролиза АТФ, в разведении от одного до 50. Далее приготовьте ванну из сухого льда и этанола для быстрой заморозки образцов, чтобы остановить реакцию.

В резиновое ведро для льда или другую безопасную емкость добавьте несколько кусочков сухого льда и осторожно насыпьте от 70% до 100% этанола, чтобы покрыть сухой лед. Разведите очищенный белок в буфере 1X HNG и держите его на льду. Настройте реакции гидролиза АТФ в подготовленных пробирках объемом 0,5 миллилитра, добавив заранее рассчитанный объем воды для достижения конечного объема реакции в 30 микролитров.

Затем шесть микролитров 5X HNG или другого буфера, три микролитра 100 миллимолярной смеси АТФ хлорида магния и от 0,25 до пяти микромолярных белков. Инкубируйте буфер только в отрицательном контрольном состоянии, при котором белок не добавляется. Далее убираем из реакции пять микролитров при умножении на ноль.

Затем разведите аликвоту один к 50 в подготовленной 1,5 миллилитровой пробирке, содержащей 245 микролитров буфера HNG. Немедленно заморозьте образец в ванне с сухим льдом и этанолом. Инкубируйте реакции при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы гидролиз АТФ происходил в течение одного часа.

Через каждый интервал удалите из реакции пять микролитров аликвот и добавьте в помеченные пробирки с образцами, содержащие буфер HNG, как и раньше. В конце реакции гидролиза АТФ переместите разведенные образцы в морозильную камеру с температурой 80 градусов Цельсия для хранения. Чтобы убедиться, что все образцы полностью заморожены, подождите не менее 10 минут, прежде чем продолжить.

Разморозьте разбавленные образцы, содержащие аликвоты реакции гидролиза АТФ, из каждой временной точки при комнатной температуре. Затем подготовьте планшет на 96 лунок, содержащий образцы и стандарты фосфатов. В пробирке объемом 0,5 миллилитра разведите стандартный фосфат с 800 микромоль до 40 микромолей, добавив 5,5 микролитров стандарта к 104,5 микролитрам буфера HNG.

Хорошо перемешайте и добавьте 100 микролитров этого стандартного 40 микромолярного фосфата в лунку А1 из 96-луночной пластины. Добавьте 50 микролитров буфера HNG в лунки от B1 до H1 для последовательного разведения стандарта фосфата один к одному. Удалите 50 микролитров 40 микромолярного фосфата из лунки А1, добавьте его к 50 микролитрам буфера для анализа в лунке В1 и перемешайте.

Затем удалите 50 микролитров из лунки В1 и добавьте ее в лунку С1, продолжая разведение через лунку В1. Выбросьте 50 микролитров из лунки G1 после смешивания, чтобы убедиться, что каждая лунка имеет одинаковый объем. Скважина H1 должна содержать только буфер для создания стандарта фосфата от 40 до нуля микромоляров. Далее добавьте в тарелку по 50 микролитров каждого образца в двух экземплярах.

Добавляйте сэмплы из одной временной точки в столбцы по вертикали и из разных временных точек по горизонтали. Это позволяет получить до восьми образцов и пять временных точек на пластину. С помощью стерильной пипетки удалите достаточное количество малахитового зеленого мелиптата фосфатного реагента, чтобы добавить по 100 микролитров в каждую из лунок, содержащих образцы и стандарты.

Добавьте реагент для обнаружения в чашку для удобного пипетирования с помощью многоканальной пипетки. Не заливайте реагент для обнаружения непосредственно в чашку, так как это может привести к загрязнению фосфатами. С помощью многоканальной пипетки добавьте 100 микролитров реагента для обнаружения фосфатов в каждую лунку и тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз последовательное количество раз, не вводя пузырьки, действуя в порядке от последней временной точки до первой временной точки.

Оставьте пластину при комнатной температуре на 25 минут или в соответствии с инструкциями производителя. Чтобы количественно оценить результаты, считайте абсорбцию образцов на 650 нанометрах с помощью считывателя микропланшетов с абсорбцией. Приведены репрезентативные результаты кинетической и конечной АТФазы, в которых определяется активность дикого типа и мутантных форм секреции АТФазы/ЭПSE второго типа в присутствии и отсутствии стимулятора кардиолипина.

Здесь представлены результаты кинетической кардиолипин-стимулированной АТФазы, демонстрирующие линейное высвобождение фосфатов с течением времени для EPSE дикого типа и двойного лизинового мутанта, при этом бычий сывороточный альбумин служит в качестве отрицательного контроля. Эти данные можно представить в виде количества фосфата, высвобождаемого в минуту, деленного на концентрацию белка для количественного определения и сравнения активности АТФазы каждого белка. Данные указывают на то, что два остатка лизина, K417 и K419, вносят свой вклад в кардиолипин-стимулированную АТФазную активность EPSE.

Сравнение АТФазной активности тех же белков без кардиолипиновой стимуляции показывает, что эти два остатка лизина не способствуют низкой базальной активности EPSE, а скорее способности белка стимулироваться кардиолипином. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как быстро и точно количественно определить активность АТФазы очищенных белков. При попытке выполнить эту процедуру важно учитывать чувствительность реагента для обнаружения фосфатов.

Чтобы избежать загрязнения фосфатами, мы рекомендуем использовать одноразовую пластиковую посуду и сверхчистую воду, а также проводить исключение из размера или ионообменную хроматографию после очистки белка.