Совокупный размер Оптимизация в Микролунки, для подвески на основе сердечной дифференциации человеческого плюрипотентные стволовые клетки
September 25th, 2016
Обычные методы для инициирования Суспензия на основе совокупного сердечной дифференциацию человеческих плюрипотентных клеток (стебли hPSCs) являются сталкивалась с культурой гетерогенности по отношению к совокупной форме и размеру. Здесь мы опишем надежный метод для сердечной дифференциации с использованием миропланшет генерировать размер контролируемых HPSC агрегатов культивируют в условиях, способствующих сердечных.
Сначала центрифугируйте одноклеточную человеческую плюрипотентную стволовую клетку, или суспензию HPSC, в 200 раз больше g в течение пяти минут. После центрифугирования аспирируйте промывочную среду и повторно суспендируйте клетки в агрегационной среде с плотностью от 1,2 до 10 до шестой клетки на миллилитр. Далее засейте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую лунку на подготовленной микролуночной пластине, и равномерно распределите клетки.
Чтобы засеять большое количество лунок, периодически проводите вихревую суспензию клеток, чтобы не допустить оседания. После посева центрифугируйте пластину при 200-кратном g в течение пяти минут. После вращения понаблюдайте за планшетом под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки вращаются на дно каждой микролунки.
Затем инкубируйте планшет в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия в гипоксическом инкубаторе с 5% C-O и 5% O 2. Через день после агрегации осмотрите агрегаты под микроскопом. По сравнению с непосредственной агрегацией после центрифуги, они должны выглядеть неповрежденными с гладкими краями.
Удалите надосадочную жидкость, держа микролуночный планшет горизонтально и поместив наконечник микропипеттора P-1000 на поверхность питательной среды и напротив края лунки. Затем медленно удаляйте среду, стараясь не потревожить агрегаты на дне микролунок. После снижения уровня среды примерно до одного-двух миллиметров от текстурированной поверхности микролунки, медленно наклоните пластину и медленно отсасывайте оставшуюся среду из лунки.
Добавьте один миллиметр свежеприготовленной предварительно подогретой индукционной среды, прижав кончик пипетки к внутреннему краю лунки и очень медленно дозируя среду у внутренней стенки лунки. Верните тарелку в инкубатор в гипоксических условиях на трое суток. На четвертый день используйте пятимиллилитровую серологическую пипетку для сбора заполнителей из каждой лунки микролуночного планшета.
Соберите до 10 лунок заполнительной суспензии в 15-миллилитровую коническую трубку. Дайте агрегатам отстояться в течение 15 минут в гипоксическом инкубаторе. После того, как агрегаты осядут, осторожно отсадите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте агрегаты в десяти миллилитрах предварительно подогретой промывочной среды, чтобы удалить остаточные индуктивные цитокины.
Центрифугируйте агрегаты при 50-кратном g в течение двух минут. После центрифугирования отобрать надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулированные агрегаты в предварительно нагретой среде второй ступени. Перенесите агрегатную суспензию на 24-луночную сверхнизкую насадочную пластину по одному миллилитру на лунку.
Наблюдайте за агрегатами под микроскопом как однородные кластеры с плотными ячейками. Инкубировать в условиях гипоксии до шестого дня. На шестой день скапливайте до 10 миллилитров заполнителей на 15-миллилитровую коническую трубку, как и раньше.
После того как агрегаты осядут, отсадите надосадочную жидкость и снова суспендируйте агрегаты в предварительно нагретой среде третьей стадии. С помощью пятимиллилитровой серологической пипетки перераспределите агрегаты в 24-луночную сверхнизкую насадочную пластину, по одному миллилитру на лунку. Произведите полную смену среды на 10-й день культивирования.
На 12-й день перенесите клетки в нормоксические условия культивирования с содержанием 20% кислорода и 5% углекислого газа на оставшуюся часть периода культивирования. После 12 дней дифференцировки, что соответствует шести дням на третьей стадии индукции сердца, наблюдались сильные совокупные сокращения. На 17-й день 74,8% клеток были положительными на сердечный тропонин Т по данным проточной цитометрии, на что указывает заполненная часть гистограммы.
Также показаны клетки, окрашенные только вторичным антителом, что показано незаполненным участком гистограммы. Во время этой процедуры важно хорошо промыть агрегаты на четвертый день, чтобы удалить следовые уровни цитокинов, в частности активина-А, который способствует дифференцировке эндодермы, за счет сердечной индукции. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как холодное культивирование индуктивных типов клеток в совокупности, чтобы ответить на другие вопросы, например, как паракринная сигнализация от соседних эмбриональных тканей влияет на дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток человека в сердечную линию.
Обзор
Эта статья представляет надежный метод кардиогенной дифференцировки человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) с использованием микроблюдцев для создания агрегатов с контролируемым размером. Метод устраняет проблемы гетерогенности культур, связанные с традиционными методами.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Кардиогенная дифференцировка
- Тканевая инженерия
Предпосылки
- Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSC) могут дифференцироваться в различные типы клеток, включая кардиомиоциты.
- Традиционные методы часто приводят к образованию агрегатов различных размеров и форм, что влияет на результаты дифференцировки.
- Технология микроблюдцев предлагает решение для создания однородных агрегатов.
- Условия, способствующие кардиогенезу, важны для эффективной дифференцировки.
Цель исследования
- Разработать метод формирования агрегатов hPSC с контролируемым размером.
- Улучшить устойчивость результатов кардиогенной дифференцировки.
- Способствовать дальнейшим исследованиям в области тканевой инженерии сердца.
Используемые методы
- Центрифугирование суспензии hPSC для формирования агрегатов.
- Использование микроблюдцев для контроля размера агрегатов.
- Инкубация в гипоксических условиях для стимулирования кардиогенной дифференцировки.
- Последовательные смены среды для индукции стадий дифференцировки.
Основные результаты
- Были сформированы и поддерживались однородные агрегаты в течение всего процесса дифференцировки.
- Была зарегистрирована значительная экспрессия кардиального тропонина T в дифференцированных клетках.
- Улучшенное удаление индуцирующих цитокинов способствовало более высокой приверженности кардиальному линей.
- После 12 дней дифференцировки наблюдались контракции на уровне всего агрегата.
Выводы
- Метод микроблюдцев обеспечивает надежный подход к кардиогенной дифференцировке hPSC.
- Агрегаты с контролируемым размером приводят к более устойчивым результатам дифференцировки.
- Эта техника может быть применена для дальнейшего исследования развития сердца и моделирования заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Controlling aggregate size in suspension-based cardiac differentiation addresses a key bottleneck in hPSC-derived cardiomyocyte production: culture heterogeneity leading to variable yields. By enforcing uniform aggregate formation via microwell technology, this method enhances predictive confidence in differentiation outcomes, supporting scalable and reproducible preclinical model generation. This positions the approach as a strategic tool for de-risking cardiac lineage commitment in early discovery and translational workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of size-dependent signaling pathways in cardiac induction, clarifying mechanistic drivers of lineage specification.
- Operational Value: Reduces variability in aggregate formation, improving reproducibility across experiments and teams.
- Predictive Value: Supports dose-response modeling of morphogen exposure by standardizing aggregate geometry as a controlled variable.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces uniform microtissues suitable for high-content imaging and flow cytometry-based cardiomyocyte quantification.
- Scalability: Microwell plate format allows parallel processing of multiple conditions or genetic backgrounds for comparative screening.
- Quantitative Output: Enables consistent measurement of cardiac troponin T-positive cells as a functional readout for compound or genetic perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Generates scalable, homogeneous cardiac aggregates for modeling inherited cardiomyopathies or drug-induced cardiotoxicity.
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage differentiation with preclinical validation by providing lot-to-lot consistent cellular material.
- Mechanistic De-risking: Minimizes confounding variables from aggregate size heterogeneity, increasing confidence in phenotype-to-genotype associations.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized hPSC differentiation, which feeds into downstream applications such as disease modeling, safety pharmacology, and regenerative medicine candidate evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing around biophysical cues in cardiac lineage commitment through precise control of aggregate size and shape.
- Screening: Delivers reproducible microtissue arrays for compound library screening with reduced noise from aggregation variability.
- Analytics: Facilitates quantitative flow cytometry and imaging readouts (e.g., cardiac troponin T) with improved signal-to-noise due to population homogeneity.
- Translational Research: Provides a scalable source of cardiomyocytes for preclinical functional assays, including contractility and electrophysiology.
- Enterprise Reuse: Microwell plates can be reused across projects and cell lines, supporting platform-level standardization in stem cell differentiation workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in differentiation outcomes by minimizing biological noise from aggregate size variation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput via standardized, scalable aggregate formation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in early cardiac programs by reducing false negatives from inefficient differentiation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted resource allocation based on reliable cardiomyocyte yield metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hPSC culture, aggregate handling, and hypoxic incubation systems.
- Dependent on access to microwell plates with defined well dimensions and low-attachment surfaces.
- Necessitates standardized medium exchange protocols to avoid aggregate disruption during washing steps.
- Requires validation across hPSC lines to ensure size-to-differentiation efficiency relationships are consistent.
- Limited by the need for specialized equipment (hypoxic incubators, low-attachment plates) and optimized cytokine wash steps to prevent off-target differentiation.
