Совокупный размер Оптимизация в Микролунки, для подвески на основе сердечной дифференциации человеческого плюрипотентные стволовые клетки
25 сентября 2016 г.
Обычные методы для инициирования Суспензия на основе совокупного сердечной дифференциацию человеческих плюрипотентных клеток (стебли hPSCs) являются сталкивалась с культурой гетерогенности по отношению к совокупной форме и размеру. Здесь мы опишем надежный метод для сердечной дифференциации с использованием миропланшет генерировать размер контролируемых HPSC агрегатов культивируют в условиях, способствующих сердечных.
Сначала центрифугируйте одноклеточную человеческую плюрипотентную стволовую клетку, или суспензию HPSC, в 200 раз больше g в течение пяти минут. После центрифугирования аспирируйте промывочную среду и повторно суспендируйте клетки в агрегационной среде с плотностью от 1,2 до 10 до шестой клетки на миллилитр. Далее засейте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую лунку на подготовленной микролуночной пластине, и равномерно распределите клетки.
Чтобы засеять большое количество лунок, периодически проводите вихревую суспензию клеток, чтобы не допустить оседания. После посева центрифугируйте пластину при 200-кратном g в течение пяти минут. После вращения понаблюдайте за планшетом под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки вращаются на дно каждой микролунки.
Затем инкубируйте планшет в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия в гипоксическом инкубаторе с 5% C-O и 5% O 2. Через день после агрегации осмотрите агрегаты под микроскопом. По сравнению с непосредственной агрегацией после центрифуги, они должны выглядеть неповрежденными с гладкими краями.
Удалите надосадочную жидкость, держа микролуночный планшет горизонтально и поместив наконечник микропипеттора P-1000 на поверхность питательной среды и напротив края лунки. Затем медленно удаляйте среду, стараясь не потревожить агрегаты на дне микролунок. После снижения уровня среды примерно до одного-двух миллиметров от текстурированной поверхности микролунки, медленно наклоните пластину и медленно отсасывайте оставшуюся среду из лунки.
Добавьте один миллиметр свежеприготовленной предварительно подогретой индукционной среды, прижав кончик пипетки к внутреннему краю лунки и очень медленно дозируя среду у внутренней стенки лунки. Верните тарелку в инкубатор в гипоксических условиях на трое суток. На четвертый день используйте пятимиллилитровую серологическую пипетку для сбора заполнителей из каждой лунки микролуночного планшета.
Соберите до 10 лунок заполнительной суспензии в 15-миллилитровую коническую трубку. Дайте агрегатам отстояться в течение 15 минут в гипоксическом инкубаторе. После того, как агрегаты осядут, осторожно отсадите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте агрегаты в десяти миллилитрах предварительно подогретой промывочной среды, чтобы удалить остаточные индуктивные цитокины.
Центрифугируйте агрегаты при 50-кратном g в течение двух минут. После центрифугирования отобрать надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулированные агрегаты в предварительно нагретой среде второй ступени. Перенесите агрегатную суспензию на 24-луночную сверхнизкую насадочную пластину по одному миллилитру на лунку.
Наблюдайте за агрегатами под микроскопом как однородные кластеры с плотными ячейками. Инкубировать в условиях гипоксии до шестого дня. На шестой день скапливайте до 10 миллилитров заполнителей на 15-миллилитровую коническую трубку, как и раньше.
После того как агрегаты осядут, отсадите надосадочную жидкость и снова суспендируйте агрегаты в предварительно нагретой среде третьей стадии. С помощью пятимиллилитровой серологической пипетки перераспределите агрегаты в 24-луночную сверхнизкую насадочную пластину, по одному миллилитру на лунку. Произведите полную смену среды на 10-й день культивирования.
На 12-й день перенесите клетки в нормоксические условия культивирования с содержанием 20% кислорода и 5% углекислого газа на оставшуюся часть периода культивирования. После 12 дней дифференцировки, что соответствует шести дням на третьей стадии индукции сердца, наблюдались сильные совокупные сокращения. На 17-й день 74,8% клеток были положительными на сердечный тропонин Т по данным проточной цитометрии, на что указывает заполненная часть гистограммы.
Также показаны клетки, окрашенные только вторичным антителом, что показано незаполненным участком гистограммы. Во время этой процедуры важно хорошо промыть агрегаты на четвертый день, чтобы удалить следовые уровни цитокинов, в частности активина-А, который способствует дифференцировке эндодермы, за счет сердечной индукции. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как холодное культивирование индуктивных типов клеток в совокупности, чтобы ответить на другие вопросы, например, как паракринная сигнализация от соседних эмбриональных тканей влияет на дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток человека в сердечную линию.
Обзор
В данной статье представлен надежный метод кардиальной дифференцировки человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) с использованием микролунок для создания агрегатов контролируемого размера. Этот метод позволяет решить проблему гетерогенности культур, характерную для традиционных методик.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Кардиальная дифференцировка
- Тканевая инженерия
Теоретические основы
- Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) могут дифференцироваться в различные типы клеток, включая клетки сердца.
- Традиционные методы часто приводят к образованию агрегатов различного размера и формы, что влияет на результаты дифференцировки.
- Технология микролунок позволяет создавать однородные агрегаты.
- Условия, стимулирующие кардиальную дифференцировку, имеют важное значение для ее эффективности.
Цель исследования
- Разработать метод получения агрегатов hPSC с контролируемым размером.
- Повысить воспроизводимость результатов кардиальной дифференцировки.
- Создать основу для дальнейших исследований в области инженерии сердечной ткани.
Используемые методы
- Центрифугирование суспензии hPSC для формирования агрегатов.
- Использование микролуночных планшетов для контроля размера агрегатов.
- Инкубация в условиях гипоксии для стимуляции кардиальной дифференцировки.
- Последовательная замена сред для индукции стадий дифференцировки.
Основные результаты
- В процессе дифференцировки формировались и поддерживались однородные агрегаты.
- В дифференцированных клетках наблюдалась значительная экспрессия сердечного тропонина Т.
- Улучшенное удаление индуцирующих цитокинов способствовало усилению коммитирования клеток в кардиальную линию.
- После 12 дней дифференцировки были отмечены сокращения по всему объему агрегата.
Выводы
- Метод с использованием микролунок представляет собой надежный подход к кардиальной дифференцировке чПСК.
- Агрегаты с контролируемым размером обеспечивают более воспроизводимые результаты дифференцировки.
- Данный метод может быть применен для дальнейшего изучения развития сердца и моделирования заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Контроль размера агрегатов при кардиальной дифференцировке в суспензии позволяет устранить одно из основных препятствий в производстве кардиомиоцитов из чПСК: гетерогенность культуры, приводящую к вариабельности выхода продукта. Обеспечивая формирование однородных агрегатов с помощью технологии микролунок, данный метод повышает предсказуемость результатов дифференцировки, что способствует масштабируемому и воспроизводимому созданию доклинических моделей. Это делает данный подход стратегическим инструментом для снижения рисков при определении кардиальной линии клеток в рамках ранних этапов поиска и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать размерно-зависимые сигнальные пути при индукции кардиомиоцитов, проясняя механистические факторы спецификации клеточных линий.
- Практическая ценность: снижает вариабельность при формировании агрегатов, повышая воспроизводимость результатов между экспериментами и исследовательскими группами.
- Прогностическая ценность: поддерживает моделирование зависимости «доза-эффект» при воздействии морфогенов за счет стандартизации геометрии агрегатов как контролируемой переменной.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение однородных микротканей, подходящих для высококонтентного имиджинга и количественного определения кардиомиоцитов методом проточной цитометрии.
- Масштабируемость: формат микролуночного планшета позволяет проводить параллельный анализ нескольких условий или генетических линий для сравнительного скрининга.
- Количественные результаты: обеспечивает стабильное измерение количества клеток, положительных по сердечному тропонину T, в качестве функционального показателя при исследовании воздействия соединений или генетических пертурбаций.
Трансляционные и доклинические исследования
- Система, релевантная заболеванию: позволяет создавать масштабируемые однородные сердечные агрегаты для моделирования наследственных кардиомиопатий или лекарственной кардиотоксичности.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между дифференцировкой на этапе поиска и доклинической валидацией за счет предоставления клеточного материала, однородного от серии к серии.
- Снижение механических рисков: минимизирует влияние мешающих факторов, обусловленных неоднородностью размеров агрегатов, что повышает достоверность ассоциаций между фенотипом и генотипом.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая стандартизированную дифференцировку hPSC, что позволяет использовать полученные результаты в таких последующих приложениях, как моделирование заболеваний, фармакология безопасности и оценка кандидатов для регенеративной медицины.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о влиянии биофизических факторов на определение сердечной линии дифференцировки за счет точного контроля размера и формы агрегатов.
- Скрининг: позволяет получать воспроизводимые массивы микротканей для скрининга библиотек соединений с меньшим уровнем шума, вызванного вариабельностью агрегации.
- Аналитика: облегчает количественный анализ методом проточной цитометрии и визуализации (например, сердечного тропонина Т) с улучшенным соотношением сигнал/шум благодаря однородности популяции.
- Трансляционные исследования: служит масштабируемым источником кардиомиоцитов для доклинических функциональных тестов, включая анализ сократимости и электрофизиологию.
- Повторное использование: микролуночные планшеты могут быть использованы повторно в различных проектах и с разными клеточными линиями, что способствует стандартизации рабочих процессов дифференцировки стволовых клеток на уровне платформы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования результатов дифференцировки за счет минимизации биологического шума, вызванного вариациями размера агрегатов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и пропускную способность благодаря стандартизированному и масштабируемому формированию агрегатов.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность в принятии решений о продолжении или прекращении ранних программ по изучению кардиомиоцитов за счет сокращения количества ложноотрицательных результатов, вызванных неэффективной дифференцировкой.
- Влияние на портфель: Обеспечивает распределение ресурсов с учетом рисков на основе надежных показателей выхода кардиомиоцитов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами hPSC, манипуляциями с агрегатами и системами гипоксической инкубации.
- Зависит от наличия микролуночных планшетов с определенными размерами лунок и поверхностями с низкой адгезией.
- Необходимы стандартизированные протоколы замены среды, чтобы избежать разрушения агрегатов на этапах промывки.
- Требуется валидация на нескольких линиях hPSC для подтверждения стабильности зависимости эффективности дифференцировки от размера агрегатов.
- Ограничено необходимостью в специализированном оборудовании (гипоксические инкубаторы, планшеты с низкой адгезией) и оптимизацией этапов промывки цитокинами для предотвращения нецелевой дифференцировки.
