Name: Визуализации кальция в Drosophila При активации Egg (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Узнайте метод визуализации кальция при активации яйца у Drosophila melanogaster. Этот протокол позволяет исследовать динамику кальция и его роль в развитии с высоким пространственным разрешением.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы благодарны Лаура Bampton, Алекс Дэвидсон, Ричард Партон, Арита Ачарья за помощь при подготовке этой рукописи; Мариана Wolfner для обсуждения активации яйца; Мэтт Wayland для поддержки формирования изображения; и Nan Ху для общей поддержки в лаборатории. Эта работа была поддержана Кембриджского университета, ISSF в ТТЦ [грант номер 097814].

Примечание: Выполнить все операции, при комнатной температуре, если не указано иное. 1. Подготовка к Dissection Примечание: Описанные здесь шаги в соответствии с E. Гавис, Принстонский университет и Weil и др. и др. 18. Выполните следующие шаги, за два дня до съемки. <ol><li> Возьмем муху флакон, содержащий приблизительно 10 мл твердой пищи и добавить небольшое количество сухих дрожжей на один угол, менее 1 г достаточно. Примечание: Для получения информации о летучей флаконах или пищевых продуктов см &#39;Drosophila Техническое обслуживание »19. </li><li> Добавьте 1 - 3 капли воды для гидратации дрожжей. </li><li> Установите флакон в сторону под углом 45 ° и позволяют 3 - 5 мин для дрожжей, чтобы принять вверх воду. </li><li> В то время как дрожжи поглощает воду, выбрать бутылку мух , экспрессирующих UASt- Миэр GCaMP5 20 , приводимый Тюб-VP16GAL4 (называемый GCaMP5) , которые в последнее время появились (в myristoyняющей форма GCaMP5 была выбрана, чтобы обеспечить высокое отношение сигнал-шум путем привязывания к Geci к мембране в яйце). </li><li> Анестезировать мух в бутылке с CO 2 газа. Обязательно держите бутылку перевернутой таким образом, чтобы не потерять мух в мокрой пищи. </li><li> Совет анестезированных мух на СО 2 колодки и сортировки 10 - 15 самок и 5 самцов с помощью кисти под рассекает микроскопом. Примечание: стандарт включает мужчин, чтобы обеспечить здоровые женщины для рассечения. </li><li> Когда флакон с шага 1.3 будет готова, добавить выбранные мух во флакон. Позаботьтесь, чтобы держать флакон в горизонтальном положении, пока мухи не станут активными. </li><li> Помещают пробирку при 25 ° С в течение приблизительно 36 часов. </li><li> Возвращение оставшихся мух от СО 2 подушки к бутылке или выбраковки. </li></ol> 2. Режущая Drosophila Яичники Примечание: Описанные здесь шаги в соответствии с Weil и др. и др. <sдо&gt; 18. <ol><li> После того, как 36 ч, анестезию мух из дрожжевого флакона с CO 2. </li><li> После того, как мухи внутри флакона анестезируют кончик их на СО 2 площадку для сортировки с кистью под микроскопом рассекает. </li><li> Выберите женщину. </li><li> Изолировать два яичники от самки. Для полного детального протокола см Weil эт. и др. 18. В итоге: <ol><li> Поместите небольшую каплю окисленной Галокарбоновое масло (серия 95) на N: 1,5, 22 х 40 мм покровным. </li><li> Возьмитесь самки с пинцетом в передней части живота. </li><li> Держа самка под микроскопом рассекает, используйте второй набор щипцов, чтобы аккуратно снять заднюю самки. </li><li> Протрите заднюю ткань от второго щипцами. </li><li> Выдавить на животе полости со вторыми пинцетом от передней к задней части живота. Два непрозрачные яичники должны придерживаться щипцов, когда за пределами FEMAле. </li><li> Прикоснитесь к яичники в масло. </li><li> Удалите ткань из пинцета, вытирая щипцов. </li><li> Повторите эти действия (2.4.1 - 2.4.7), чтобы получить три покровные, каждый из которых содержит яичники из одной мухи. </li></ol></li></ol> 3. Индивидуальные изолируя Зрелые яйца <ol><li> Под стандартным рассекает микроскопом с увеличением, установленным в 4 раза, на первом покровное с шага 2.4, разделить два яичники, оторвав яйцевод. </li><li> Представьте пару закрытых щипцов в центре одного яичника, следя за тем, чтобы не проколоть любые яичные камеры. </li><li> Вставьте стандартный рассекает зонд в центре яичник рядом с закрытым пинцетом. </li><li> Аккуратно перетащите рассекает зонд через яичнике к заднему полюсу, где зрелые яйца (этап 14 яиц камеры) расположены. </li><li> Повторите шаги 3.1 - 3.4 2 - 5 раз в зависимости от размера яичнике и количества яиц. Примечание: Добавление CO 2 </к югу&gt; обычно вызывает осаждение одного яйца, которое появится больше с поднятыми спинных придатков, чем предварительно депонированы яиц. Это яйцо должно быть отброшено для работы с изображениями, так как она уже была активирована внутри самки. Примечание: Зрелые яйца могут легко отделить от яичников соединительной ткани. </li><li> Если не зрелые яйца не видны снаружи яичника, продолжайте мягко дразнит с рассекает зондом. </li><li> После того, как зрелые яйца видны на покровное за пределами яичник, маневрировать 3 - 5 в линию в центре покровное. Примечание: Для достижения наилучших результатов, запустить зонд осторожно вдоль стороны яйца. Примечание: Избегайте потянув на спинных придатков, так как это может повредить яйцо. Примечание: В зависимости от будущего изображения установка, выравнивание яйца примерно 200 мкм друг от друга перпендикулярно покровное для максимальной области визуализации. </li><li> После того, как выровнен, удалите остальную часть ткани яичников, перетащив его от выровненных яиц с использованием пorceps. </li><li> Удалите излишки масла путем протирания углу медицинской салфеткой. Будьте осторожны, чтобы не касаться зрелых яиц с медицинским вытирать, как зрелые яйца, которые контактировали будут потеряны. </li><li> Draw перекрестие на покровное с маркером для упрощения размещения образца под микроскопом. </li><li> Установите покровное в безопасном месте и оставить подготовленные яичные камеры на покровное, чтобы отдохнуть в течение 5 - 10 мин. Это позволяет яйцу оседают в масле. Образцы могут быть использованы до 1 ч после рассечения. </li><li> Повторите шаги 3.1 - 3.11 для остальной части покровные с яичниками на них. </li></ol> 4. Подготовка к визуализации <ol><li> Доведите подготовленный буфер активации 15 до комнатной температуры. Примечание: Буфер активации представляет собой гипотонический буфер: 3,3 мМ NaH 2 PO 4, 16,6 мМ КН 2 РО 4, 10 мМ NaCl, 50 мМ КСl, 5% полиэтиленгликоль 8000, 2 мМ CaCl 2, доводили до рН 6,4 с 1: 5 отношение NaOH: КОН.Для получения дополнительной информации см Маховальда, 1983 15. Аликвоты буфера активации можно хранить при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев , и при 4 ° С в течение до 2 -х недель. </li><li> Тщательно подготовленные транспортировать покровные, буфер активации и стеклянные пипетки к средству визуализации. Примечание: Широкий поле, конфокальной, вращающийся диск или легкий лист микроскоп может быть использован. Мы рекомендуем использовать инвертированный микроскоп. Наши репрезентативные результаты были получены с помощью конфокальной микроскопии. </li><li> Цель подходит для работы с изображениями всего зрелую яйцеклетку следует выбирать (здесь: 20X 0,7 NA). </li><li> Установите первый подготовленный покровное на столике микроскопа. Будьте осторожны, чтобы не сломать покровные на сцене. </li><li> Качественно выбрать поле зрения со зрелой яйцевой камеры для активации. Не изображение проколот яичные камеры или те, с блеббинга в мембране. Примечание: шаги 4.6 - 4.7, программные команды будет меняться в зависимости от микроскопа и производителя. </li><li> Набор изображений пунктметров для стандартного GFP возбуждения (488 нм) и испускания (500 - 580 нм). Также настроен вид ярко-поле для того, чтобы визуализировать и ориентированность зрелую яйцеклетку и смещенный масло. </li><li> Выберите самый низкий Z-плоскость, где зрелые яйца видимы и установить полный Z-стек, которые необходимо принять в течение 40 мкм приблизительно 2 мкм на шаг. Установите параметры таким образом, нет никакой задержки между приобретением Z-стека. Установите временные ряды, чтобы захватить в течение примерно 30 мин. </li></ol> 5. визуализации Ex Vivo Яйцо активации <ol><li> Запустить захват изображения. </li><li> Подождите 1 - 2 полных Z-стеки должны быть приобретены. Это показывает зрелую яйцеклетку до активации. </li><li> Вывод примерно 300 мкл буфера активации в стеклянную пипетку. </li><li> Позиционирование кончик стеклянной пипетки, содержащей буфер активации под углом 45 ° над покровное, медленно переместите пипетку на траекторию луча, пока он не находится непосредственно над зрелое яйцо изображаемого. Стеклянная пипетка должнабыть 1 - 2 см выше масла. </li><li> Добавьте 1 - 2 капли буфера активации менее чем за 5 секунд от стеклянной пипетки. Это должно вытеснять масло. Избегайте добавления избытка буфера активации или прикосновением яйцо со стеклянной пипеткой, как это может привести к смещению зрелого яйца. Будьте осторожны, не прикасайтесь к покровное с пипеткой, так как это может привести к изменению в фокальной плоскости или пузырьков воздуха с образованием в иммерсионного масла между объективом и покровное. </li><li> В то время как добавление буфера активации во время получения изображения, проверьте канал светлого поля, чтобы гарантировать, что масло было перемещено буфером активации. Примечание: Это будет сначала появляются как тень из-за пипетку нарушения на пути луча, но также приведет к появлению мелких капель масла. Некоторые капли масла могут оставаться связанным со зрелой яйцеклетки, которые будут влиять на экспериментальные результаты и качество изображения. </li><li> Если масло не смещается из первоначального добавления активирующего буфера повторите шаги 5.4 - 5.6. </li><li> После того, как масло успешно смещаются, позволяют временные ряды не работать до завершения. Примечание: Из-за отека ооцитов при активации, некоторые яичные камеры резко съехать из фокальной плоскости или поля зрения при добавлении буфера активации. В этой ситуации остановить приобретение и смонтировать следующий покровное. </li><li> После того, как последовательность изображений завершила приобретение, сохранение данных. </li></ol> 6. после приобретения Обработка изображений <ol><li> Откройте набор данных, используя Фиджи (http://fiji.sc/Downloads#Fiji~~HEAD=dobj) или эквивалентное программное обеспечение для обработки изображений, а затем выберите соответствующие файлы для анализа. </li><li> Чтобы построить проекцию полученных данных выберите: Image&gt; Стеки&gt; Z-проект. </li><li> Выберите начальную Z-среза и Z-срез стоп, как правило, весь раздел. Выберите тип проекции, как правило, установлен в &quot;Max Intensity&quot;. Проверьте окошки &quot;Все временные рамки&quot;, чтобы применить выбранные настройки ко всей серии. </li><li> Еслиболее чем один флуоресцентный канал был, изображаемый с помощью инструмента Каналы для того, чтобы движение между цветами, сделать составной, или сделать изображение в оттенках серого. Выберите Image&gt; Цвета&gt; Каналы инструмент. </li><li> Для регулировки яркости и контрастности изображения выберите изображение&gt; Adjust&gt; Brightness / Contrast. </li><li> Чтобы экспортировать одно изображение, переместите ползунок временной шкалы к соответствующей рамке и выберите File&gt; Save As&gt; Jpeg или любой нужный формат. </li><li> Выберите местоположение и название для экспортируемого файла, а затем сохранить. Примечание Частота кадров с помощью программного обеспечения визуализации потребуется, чтобы дать временную метку на изображении. </li><li> Для экспорта временной ряд как фильм выберите: File&gt; Save As&gt; AVI, а затем выбрать частоту кадров (~ 7 кадров в секунду). </li><li> Выберите местоположение и название для экспортируемого файла, а затем сохранить. </li><li> Для того, чтобы сохранить измененное файл в формате Фиджи, выберите Файл&gt; Сохранить. </li></ol>

<ol><li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitioning+from+egg+to+embryo%3A+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li>
<li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li>
<li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li>
<li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li>
<li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).</li>
<li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDouglass%2C+A+%22New+Techniques+in+Systems+Neuroscience%22">New Techniques in Systems Neuroscience</a>. , Springer. (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li>
<li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22JoVE+Science+Education+Database%22">JoVE Science Education Database</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li>
<li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li>
<li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li>
<li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23(2004).</li>
<li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li>
</ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Первым важным шагом в этом протоколе является изоляция зрелых яйцеклеток без повреждений. Это может быть достигнуто путем нееврейского маневрирования яйцеклетками с помощью рассекающего зонда. Практика даст возможность выполнить эту манипуляцию без повреждения яиц. Вторым важным шагом является предотвращение потери образца при нанесении активационного буфера на зрелую яйцеклетку в масле. Нанесение активационного буфера должно производиться медленно и без контакта с покровным стеклом. Этот шаг может быть сложным, если микроскоп не обеспечивает легкий доступ к образцу. Рекомендуется перемещать подмышечные части микроскопа, такие как температурный инкубатор. 
В этот протокол могут быть внесены изменения для визуализации других флуоресцентно помеченных факторов вместо Ca2+ при активации яйца. В более общем плане, различные стадии развития дрозофилы или результаты добавления другого буфера могут быть проанализированы с помощью этого протокола. 
Устранение неполадок может потребоваться, если настройки на микроскопе не являются оптимальными для визуализации сигнала от образца. Это может быть достигнуто за счет увеличения или уменьшения мощности лазера, изменения дальности захвата и регулировки параметров Z-стека. Еще одна проблема может заключаться в том, что яйца постоянно выходят из поля зрения при добавлении буфера активации. Если это происходит регулярно, дайте зрелой икре осесть на покровных листочках в течение более длительного периода времени, от 15 до 20 минут. Имейте в виду, что использование масла с более высокой вязкостью приведет к изменению вытеснения масла за счет буфера активации. 
Этот метод, представленный здесь, ограничен рабочим расстоянием объектива, обезвоживанием зрелых яйцеклеток и возможностью расчленения зрелых яйцеклеток без повреждений. Однако, по сравнению с методами визуализации in vivo , при которых зрелый ооцит проходит через взрослую самку и откладывается 13, наш метод обеспечивает большее пространственное разрешение, возможность физического манипулирования зрелой яйцеклеткой до активации и возможность проверить роль активации яйцеклетки без оплодотворения. 
Существует множество потенциальных будущих применений этого метода, включая тестирование репортерных конструкций для клеточных компонентов при активации яйцеклетки и визуализацию волны Ca2+ на мутантном фоне 14,24. В сочетании с экспериментальными и генетическими инструментами, представленный здесь анализ активации яйцеклеток ex vivo позволяет изучать триггерные, распространяющиеся и нисходящие эффекты универсально консервативной волны Ca2+ .

Изменение внутриклеточного Са 2+ концентрации в яйце (ооцитов) активации является сохраняющимся компонентом всех изученных организмов 1,2. Это событие инициирует широкий спектр Ca 2+ -зависимые процессов, в том числе возобновление клеточного цикла и трансляции сохраненных мРНК. В связи с этим требованием , Ca 2+, визуализируя переходные изменения внутриклеточной концентрации Са 2+ является ключевой интерес. Исторически сложилось так, модельные организмы были отобраны для исследования по активации яиц на основе размера и доступности их яиц. Различные подходы к визуализации были использованы , чтобы следовать и количественной оценки изменений во внутриклеточной концентрации Са 2+ в этих системах, в том числе: Фотобелок акворина в Оризии рыбы 3; Ca 2+ чувствительные флуоресцентные красители , такие как Fura-2 в морских ежей и хомяка 4,5; и кальций - зеленый-1-декстрана в Xenopus 6. Генерация и улучшение генетически кодируемых показателей кальция (GECIs) превратило способность визуализировать динамику Ca 2+ в естественных условиях 7. Эти генетические конструкции выражаются в конкретных тканях и ограничить потребность в препаратах инвазивного ткани 8. GCaMPs являются зеленый флуоресцентный белок (GFP) , класс , основанный на GECIs , которые были очень эффективны в связи с их высоким сродством Ca 2+, отношение сигнал-шум и способность быть настроены 9-11. В присутствии ионов Са 2+, комплекс GCaMP претерпевает ряд конформационных изменений, начиная с связывание Са 2+ с кальмодулин, что приводит к увеличению флуоресцентной интенсивности GFP компонента 9. GCaMPs широко используются в исследованиях Drosophila нейронов визуализировать изменения внутриклеточного кальция 12. Недавние Applicatiпо технологии GCaMP визуализации Ca 2+ в зрелых яиц дрозофилы показал одну переходную Ca 2+ волну при активации яйца 13,14. Волны Ca 2+ могут быть визуализированы при малом увеличении во время овуляции в естественных условиях 13 или при большем увеличении с использованием ех естественных условиях анализа активации 13,14. В естественных условиях экс анализа, отдельные зрелые ооциты выделяют из яичников и активируют с использованием гипотонического раствора, именуемых активации буфера, которое было показано , чтобы резюмировать события активации 15-17 в естественных условиях. Этот анализ ех естественных условиях позволяет легко визуализировать с высоким разрешением Са 2+ волны при различных экспериментальных условиях , включая фармакологическую нарушения, физических манипуляций и генетических мутантов. Эта статья демонстрирует получение зрелых яиц дрозофилы для активации экс естественных условиях и гое последующая микроскопия используется для визуализации волны Ca 2+ с помощью GCaMP. Такой подход может быть использован для тестирования инициации и контроля волны Ca 2+ и зондировать вниз по течению результатов.

<table><tbody><tr><td>Сухие активные дрожжи</td><td>Fleischman' s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Препарирующий микроскоп</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Различные будут работать</td></tr><tr><td>Лампа</td><td>Mircotec Волоконно-оптический</td><td>MF0-90</td><td>Различные будут работать</td></tr><tr><td>Медицинские салфетки</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Маркер</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen универсальный, черный - доступен в большинстве стационарных магазинов. Сверхтонкая ширина 0,4 мм</td></tr><tr><td>CO2 pad</td><td>&nbsp; Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Защитный лист No 1.5, 22 x 50 мм</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Галокарбоновое масло, серия 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Дистрибьютор в Европе:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Масло 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Можно использовать вместо галоуглеродного масла, серия 95</td></tr><tr><td>Щипцы</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Хотя эти инструменты должны быть чистыми, использование автоклава не требуется, этанол будет достаточным.</td></tr><tr><td>Зонд</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Стеклянная пипетка</td><td>Fisherbrand,FB50251</td><td></td> <td>Пастеровские пипетки, стеклянные, без заглушки, длина 150 мм&nbsp;</td></tr><tr><td>Флакон</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&nbsp; 80 мм x 25 мм</td></tr></tbody></table>

Визуализации кальция в<em&gt; drosophila</em&gt; При активации egg

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Активация яйцеклетки — это универсальный процесс, включающий в себя ряд событий, позволяющих оплодотворенной яйцеклетке завершить мейоз и начать эмбриональное развитие. Одним из аспектов активации яйцеклеток, сохраняющимся у всех исследованных организмов, является изменение внутриклеточной концентрации кальция (Ca2+), часто называемое «волной Ca2+». В то время как скорость и количество колебаний волны Ca2+ варьируются у разных видов, изменение внутриклеточного Ca2+ является ключом к возникновению важных событий для эмбрионального развития. Эти изменения включают возобновление клеточного цикла, регуляцию мРНК, экзоцитоз корковых гранул и перестройку цитоскелета.
В зрелом яйце дрозофилы активация происходит в яйцеводе самки перед оплодотворением, инициируя сериюCa2+-зависимых событий. Здесь мы представляем протокол визуализации волны Ca2+ у дрозофилы. Этот подход обеспечивает манипулируемую систему моделей для изучения механизма волны Ca2+ и связанных с ней изменений в нисходящем потоке.

Вот мы продемонстрировали , как подготовить зрелые яйца дрозофилы для активации экс естественных условиях. Яйца , выражающие Geci включить визуализацию Ca 2+ динамика при активации яйца и начало эмбрионального развития (рисунок 1). Следует отметить , что в зависимости от GCaMP используется, в частности , наличие миристоил группы, результаты могут иметь небольшие качественные отличия 13 14. Кроме того, мы продемонстрировали роль функциональной актина во время активации яиц путем добавления ингибитора полимеризации актина, цитохалазином D, в буфер активации (рисунок 2) 14. Требование к цитоскелета при активации яиц сохраняется. В С. Элеганс, после оплодотворения, цитоскелета компоненты реорганизованы для подготовки эмбриона одноклеточных для первого асимметричного деления 21,22. В морских ежей, нарушение cytoskeleTal реорганизации после активации было показано , что влияет на клеточный цикл путем предотвращения образования цикла сократительную 23. Роль актина в опосредовании волну Са 2+ и ее вниз по течению функцию при активации яиц у дрозофилы остается полностью выяснены. У Drosophila, со-визуализация Са 2+ волн и цитоскелета может быть достигнуто с помощью этого анализа , исключая виво активации. Временные ряды нескольких каналов могут быть приобретены и динамика внутриклеточного Ca 2+ могут быть сопоставлены с изменениями в организации актина в ооцитах (рисунок 3). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Рисунок 1:. Единый Ca 2+ волна в серии Drosophila Яйцо Время активации экс естественных условиях зрелых Drosophila яйца , выражающую UASt- myrGCaMP5 следуя аddition буфера активации (АГ). Повышение цитоплазматического Са 2+ берет свое начало в заднем полюсе (B) , а затем распространяет (BF) со средней скоростью около 1,5 мкм / с. Инициирование волны, как правило, наблюдается в течение 3 мин после добавления буфера активации. После активации внутриклеточных уровней кальция зрелого яйца возвращается к предварительной активации уровней (G, H). См дополнительный фильм 1 (общее время 33 мин). Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Рисунок 2: Добавление Цитохалазин D к активации буфера возмущает Ca2+ Распространение волн. Временных рядов экс виво зрелых Drosophila яйцеклетку , выражающую UASt- myrGCaMP5 после добавления активации буфера , содержащего 10 мкг / мл цитохалазином D конечной концентрации (AH). В то время как 2+ волна Са инициируется на заднем полюсе (а), она скомпрометирована и не доходит переднюю часть яйца (F) (белые головки стрелок обозначают фронт волны). Никаких дополнительных не наблюдалось изменения Са 2+ в течение 30 мин). См дополнительный фильм 2 (общее время 30 мин). Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Рисунок 3: Co-визуализация актин и Са 2+ при ЕАктивация в GG серии дрозофилы. Время экс естественных условиях зрелых Drosophila яйца , выражающую UASt- myrGCaMP5 (Cyan) и UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) после добавления буфера активации (AH). Са 2+ волна инициирует от заднего полюса и восстанавливается как показано на рисунке 1. Актина , похоже, меняется с течением времени, белые наконечники стрел (А против Н). Отсутствие Ca 2+ детектирования сигнала в центре зрелого яйца из - за перемещения образца во время захвата изображения. Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

В данной статье описывается адаптируемый экс виво протокол для визуализации Ca 2+ во время активации яйца у дрозофилы.

Визуализации кальция в<em&gt; Drosophila</em&gt; При активации Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Основная цель данной процедуры заключается в визуализации кальция в процессе активации яйцеклеток Drosophila melanogaster. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы биологии развития, такие как определение источника, динамики и последующих функций кальция при активации яйцеклетки. Главными преимуществами данной методики являются обеспечение более высокого пространственного разрешения, возможность физического манипулирования зрелой яйцеклеткой перед активацией, а также возможность изучения роли активации яйцеклетки без оплодотворения.Как правило, лица, впервые осваивающие данный метод, сталкиваются с трудностями при выделении зрелых яйцеклеток без их повреждения, а также при нанесении активационного буфера на зрелую яйцеклетку без потери образца. Для начала данной процедуры установите 4-кратное увеличение на стереомикроскопе. На первом предметном стекле с покровным стеклом разделите два яичника, разорвав яйцевод с помощью закрытого пинцета и препаровальной иглы, стараясь не проколоть камеры с яйцеклетками.Затем введите стандартный препаровальный зонд в центр яичника, рядом с закрытым пинцетом. Осторожно проведите зондом через яичник в направлении заднего полюса, где расположены зрелые яйцеклетки. Когда зрелые яйцеклетки окажутся на покровном стекле вне яичника, расположите три–пять из них в линию по центру.Затем удалите остатки тканей яичника, отодвинув их от выровненных яйцеклеток. После этого удалите излишки масла, промокнув их уголком медицинской салфетки. Нанесите маркером перекрестие на покровное стекло, чтобы легче было найти образец под микроскопом.После этого оставьте подготовленные яйцевые камеры на покровном стекле на пять-десять минут, чтобы яйца осели в масле. Перенесите в помещение для визуализации подготовленные покровные стекла, буфер для активации комнатной температуры и стеклянные пипетки. Выберите объектив, подходящий для визуализации всего зрелого яйца.Затем установите первое подготовленное покровное стекло на предметный столик микроскопа. Далее выберите в поле зрения зрелую яйцевую камеру для активации. Установите параметры визуализации для стандартного возбуждения и эмиссии GFP.После этого настройте режим светлого поля, чтобы визуализировать и определить положение зрелого яйца и смещенного масла. Теперь выберите самую нижнюю Z-плоскость, на которой видны зрелые яйца. Установите параметры для получения полного Z-стека на глубину 40 micrometers с шагом 2 micrometers.Затем установите параметры временного ряда для захвата изображений в течение 30 минут. В рамках данной процедуры запустите захват изображений и получите один или два полных Z-стека, чтобы показать зрелую яйцеклетку до активации. Затем наберите примерно 300 µL буфера для активации в стеклянную пипетку.Расположите кончик стеклянной пипетки с буфером для активации под углом 45 градусов над покровным стеклом и медленно переместите пипетку в зону прохождения луча, пока она не окажется непосредственно над зрелой яйцеклеткой, которая визуализируется. Добавьте одну-две капли буфера для активации менее чем за пять секунд, чтобы вытеснить масло. Добавление одной-двух капель буфера для активации следует выполнять осторожно, быстро и под правильным углом.При добавлении активационного буфера во время получения изображений контролируйте канал светлого поля, чтобы убедиться, что масло было вытеснено. После успешного вытеснения масла дождитесь завершения записи временной серии. Для создания проекции полученных данных выберите начальный и конечный Z-срезы для всего сечения.После этого выберите тип проекции, например, максимальную интенсивность (maximum intensity). Затем установите флажок «Все временные кадры» (All time frames), чтобы применить выбранные настройки ко всей серии. Для регулировки яркости и контрастности изображения выберите меню «Изображение» (Image), затем «Корректировка» (Adjust) и «Яркость/Контрастность» (Brightness/Contrast).Чтобы экспортировать временной ряд в виде видеофайла, выберите File, затем Save As и выберите формат AVI. После этого установите частоту кадров. Здесь показан временной ряд зрелого яйца Drosophila ex vivo, экспрессирующего генетически кодируемый индикатор кальция после добавления активационного буфера.Повышение уровня цитоплазматического кальция начинается на заднем полюсе, после чего волна распространяется со средней скоростью примерно 1.5 micrometers per second. Запуск волны обычно наблюдается в течение трех минут после добавления активационного буфера. После активации уровни внутриклеточного кальция в зрелой яйцеклетке восстанавливаются.У Drosophila совместная визуализация кальциевой волны и актинового цитоскелета может быть реализована с помощью данного анализа активации ex vivo. Как показывают белые стрелки, актин претерпевает изменения с течением времени. Отсутствие сигнала кальция в центре зрелого яйца обусловлено смещением образца во время захвата изображения.После освоения эта методика может быть выполнена менее чем за час при условии правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости действовать осторожно при манипуляциях с яйцевыми камерами и при настройке параметров сбора данных. Данную процедуру можно адаптировать для визуализации других флуоресцентно меченных белков, органелл или индикаторов кальция при активации яйцеклетки.Это может помочь ответить на вопросы относительно источника кальция и последующих эффектов.

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Биология развития

Мы описываем создана методика для измерения и анализа запахов вызвали ответы кальция в усиков доля...

Кальций изображений запаха, вызвали ответы на Drosophila Усиков лепестка

Это видео описывает визуализацию кальция in vivo в нейронах дрозофилы с использованием GCaMP. В ролике с протоколом показано, как регистрировать изменения флуоресценции GCaMP от нейронов грибовидного тела во время эксперимента по обонятельному обусловливанию.

Дрозофила in vivo Визуализация кальция: метод функциональной визуализации активности нейронов

Это видео демонстрирует технику визуализации кальция в отдельных нейронах поведения Caenorhabditis elegans с использованием генетически закодированных флуоресцентных репортерных белков. В нем описаны шаги, связанные с визуализацией движения червей и измерением коэффициентов флуоресценции репортеров от нейронов для корреляции внутриклеточных уровней кальция с активностью нейронов и поведенческими изменениями во время откладывания яиц.

Визуализация кальция в отдельных нейронах, регулирующих яйцекладку у Caenorhabditis elegans

Это видео демонстрирует метод визуализации кальция in vivo с использованием синаптически локализованных кальциевых сенсоров у мух. В нем описаны этапы подготовки мух к микроскопии, проведению обонятельного кондиционирования и визуализации притока кальция, вызванного запахом.

В естественных условиях Визуализация кальция с использованием синаптически локализованных кальциевых сенсоров у Drosophila melanogaster

Источник: Ишимото, Х. et. al., Визуализация кальция ex vivo для визуализации реакции мозга на эндокринную сигнализацию у дрозофил. J. Vis. exp.} (2018)Это видео демонстрирует визуализацию кальция для изученияДрозофила реакция мозга на нейропептиды. Нейроны, экспрессирующие флуоресцентный индикатор кальция, выявляют внутриклеточную динамику кальция и функциональные реакции на сигнальные молекулы.

Визуализация кальция ex vivo для изучения реакции мозга дрозофил на нейропептиды

Этот документ описывает протокол для ex vivo кальция томография головного мозга дрозофилы . В этом методе натуральных или синтетических соединений может применяться в буфер, чтобы проверить свои способности для активации определенной нейронов в головном мозге.

Ex Vivo Кальция изображений для визуализации мозга ответы на эндокринных сигнализации в дрозофилы

Здесь мы представляем протокол, с которым до и / или postsynaptic кальция могут быть визуализированы в контексте drosophila обучения и памяти. In vivo изображения кальция с использованием синапитично локализованных датчиков кальция в сочетании с классической обонятельной парадигмы кондиционирования, таким образом, что синаптической пластичности, лежащей в основе этого типа ассоциативного обучения может быть определена.

В Vivo оптические изображения кальция обучения индуцированной синаптической пластичности в Drosophila меланогастер

Здесь мы описываем протокол обнаружения и локализации белка и РНК эмбриона дрозофилы от сбора до предварительного встраивания и встраивания, иммуноокрашивания и гибридизации мРНК in situ .

Протокол иммуногистохимии и распределения РНК in-situ в раннем эмбрионе дрозофилы

Здесь мы представляем протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo , что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.

Ex vivo Кальциевая визуализация для модели эпилепсии дрозофилы

Здесь мы представляем протоколы и инструменты для визуализации кальция во время оплодотворения и раннего эмбриогенеза с использованием генетически кодируемого кальциевого репортера, экспрессируемого в зародышевой линии модельной нематоды C. elegans.

Визуализация in vivo переходных процессов кальция во время оплодотворения и раннего развития у C. elegans

Мы представляем протоколы визуализации кальция для обонятельного нейрона личинки дрозофилы с использованием местного тканевого клея для иммобилизации. Этот метод повышает стабильность, облегчая проведение надежных экспериментов in vivo и ex-vivo . Пользовательские скрипты R анализируют сигналы кальция, обеспечивая эффективную платформу для детальных нейрофизиологических исследований.

Визуализация кальция in vivo и ex-vivo нейроном обонятельной цепи личинки Drosophila melanogaster третьего возраста

Узнайте метод визуализации кальция при активации яйца у Drosophila melanogaster. Этот протокол позволяет исследовать динамику кальция и его роль в развитии с высоким пространственным разрешением.

Визуализации кальция в

Больше видео