Визуализации кальция в Drosophila При активации Egg

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации кальция во время активации яйцеклеток у Drosophila melanogaster. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии развития, такие как источник, динамика и последующая роль кальция при активации яйцеклетки. Основными преимуществами этого метода являются обеспечение более высокого пространственного разрешения, физические манипуляции со зрелой яйцеклеткой до активации и проверка роли активации яйцеклетки без оплодотворения.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности с выделением зрелых яйцеклеток без повреждений и применением активационного буфера к зрелой яйцеклетке без потери образца. Чтобы начать эту процедуру, установите увеличение препарирующего микроскопа на 4X. На первом покровном листе разделите два яичника, разорвав яйцевод парой закрытых щипцов и препарирующим зондом, стараясь не проколоть яйцеклетки.

Далее введите стандартный рассекающий зонд в центр яичника, рядом с закрытыми щипцами. Аккуратно проведите рассекающим зондом через яичник, к заднему полюсу, где находятся зрелые яйцеклетки. Как только зрелые яйцеклетки станут заметны на покровном листе снаружи яичника, переместите от трех до пяти из них в линию в центре.

Далее удалите остатки ткани яичника, оттащив ее от выровненных яйцеклеток. Затем удалите излишки масла, промокнув его уголком медицинской салфетки. Нарисуйте маркером перекрестие на покровном листе, чтобы найти образец под микроскопом.

После этого оставьте подготовленные камеры для яиц на покровном листе отдохнуть на пять-10 минут, чтобы яйца осядли в масле. Принесите в центр визуализации подготовленные покровные стекла, буфер для активации при комнатной температуре и стеклянные пипетки. Выберите объектив, подходящий для визуализации всей зрелой яйцеклетки.

Затем установите первый подготовленный покровный стакан на предметный столик микроскопа. Далее выберите поле зрения камеры со зрелым яйцом для активации. Задайте параметры визуализации для стандартного возбуждения и излучения GFP.

После этого настройте яркое поле для того, чтобы визуализировать и сориентировать созревшее яйцо и вытесненное масло. Теперь выберите самую нижнюю Z-плоскость, где видны зрелые яйца. И установите полный Z-стек, который будет взят для 40 микрометров со скоростью два микрометра на шаг.

Затем установите временной ряд для захвата изображений в течение 30 минут. В этой процедуре начните съемку изображения и получите от одного до двух полных Z-стеков, чтобы показать зрелую яйцеклетку до активации. Далее извлеките примерно 300 микролитров активационного буфера в стеклянную пипетку.

Расположите кончик стеклянной пипетки, содержащей активационный буфер, под углом 45 градусов над покровным стеклом и медленно перемещайте пипетку по траектории луча, пока она не окажется прямо над зрелой яйцеклеткой, на которой делается изображение. Добавьте одну-две капли активационного буфера менее чем за пять секунд, чтобы вытеснить масло. Добавление одной-двух капель буфера активации должно быть сделано под правильным углом, аккуратно и быстро.

При добавлении буфера активации во время получения изображения проверьте канал светлого поля, чтобы убедиться, что масло было вытеснено. После успешного вытеснения масла дайте временному ряду протянуться до завершения. Чтобы построить проекцию полученных данных, выберите начальный Z-срез и конечный Z-срез для всего раздела.

После этого выберите тип проекции, например, максимальную интенсивность. Далее ставим галочку в поле Все таймфреймы, чтобы применить выбранные настройки ко всему ряду. Чтобы настроить яркость и контрастность изображения, выберите «Изображение», затем «Настроить», а затем «Яркость/контрастность».

Чтобы экспортировать временной ряд в виде фильма, выберите «Файл», затем «Сохранить как», а затем «AVI». Затем выберите частоту кадров. Здесь показан временной ряд зрелой яйцеклетки дрозофилы ex vivo, экспрессирующей генетически кодируемый индикатор кальция после добавления активационного буфера.

Повышение цитоплазматического кальция начинается на заднем полюсе, а затем распространяется со средней скоростью около 1,5 микрометров в секунду. Инициация волны обычно наблюдается в течение трех минут после добавления буфера активации. После активации внутриклеточный уровень кальция в зрелой яйцеклетке восстанавливается.

У дрозофил совместная визуализация кальциевой волны и цитоскелета актина может быть достигнута с помощью этого анализа активации ex vivo. Актин, по-видимому, меняется с течением времени, о чем свидетельствуют белые наконечники стрелок. Отсутствие детектирования сигнала кальция в центре зрелой яйцеклетки связано с движением образца во время захвата изображения.

После освоения вся эта техника может быть выполнена менее чем за час, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно не торопиться при маневрировании яйцевыми камерами, а также при настройке параметров для захвата. Эта процедура может быть адаптирована для визуализации других флуоресцентно меченых белков, органелл или показателей кальция при активации яйца.

Это может помочь решить вопросы, касающиеся источника кальция и последующих эффектов.