Метод Targeted Выделение клеток с помощью стеклянной поверхности функционализации

Общая цель этого процесса функционализации стеклянной поверхности заключается в том, чтобы обеспечить бережный захват и высвобождение интересующих клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ангиогенеза опухолей, позволяя проводить скрининг клеточных биомаркеров, указывающих на лекарственную устойчивость. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она полностью настраивается практически для любого типа интересующих клеток.

До тех пор, пока существует антитело, специфичное для данного типа клеток, поверхность может быть адаптирована для его захвата. Хотя этот метод может дать представление об ангиогенезе рака, он также может быть применен к другим заболеваниям, поскольку очищенные образцы необходимы для разработки более персонализированных схем лечения. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы пытались разработать механизм обратимого высвобождения для захвата клеток, используя взаимодействие между дестиобиотином и семейством адивинов.

После очистки стеклянной поверхности в кислородной плазменной машине в течение пяти минут согласно текстовому протоколу приготовьте 2,5 миллилитра 2% восстановленного 3-аминопропилтриэтоксисилана, или раствора APTES, соединив 50 микролитров APTES и 2,45 миллилитров этанола в конической пробирке. Нанесите раствор APTES пипеткой на стеклянные поверхности, затем накройте поверхности и поместите их на платформенный шейкер при комнатной температуре на 50 минут, чтобы равномерно распределить слой APTES. Тем временем разогрейте духовку до 55 градусов Цельсия для восьми- и 24-луночных тарелок или до 90 градусов Цельсия для стеклянной посуды.

После извлечения пластин из шейкера используйте этанол для промывки стеклянных поверхностей в соответствии с текстовым протоколом. С помощью 100% газообразного азота высушите поверхности. Затем поместите восьми- и 24-луночные тарелки в духовку на два часа, а стеклянную посуду в духовку на один час.

Затем приготовьте 2,5 миллилитров d-дестиобиотина, или раствора DSB, смешав 1,5 миллиграмма на миллилитр DSB с 37,5 микролитрами ДМСО, и добавив пять миллиграммов на миллилитр EDC к 2,462,5 микролитрам 0,1 молярного буфера MES, pH 6. Затем объедините два решения. Через 15 минут добавьте один микролитр BME, чтобы погасить реакцию между DSB и EDC.

Выньте горячие стеклянные поверхности APTES из духовки и дайте им остыть в течение пяти-10 минут. Добавьте буфер MES на стеклянные поверхности, чтобы промыть их, держа пипетку под углом 70 градусов так, чтобы наконечник не был прямо направлен на поверхность. Затем выгрузите и проведите буфер из фиксированной точки, например, из угла колодца.

Затем используйте буфер MES для полоскания еще два раза. Нанесите раствор DSB на стеклянные поверхности. Переложите их на влажное бумажное полотенце в чашке Петри, накройте тарелку крышкой и выдерживайте в холодильнике от 18 до 24 часов.

После инкубации при четырех градусах Цельсия используйте PBS для трех промывки каждой стеклянной поверхности, как было показано ранее в этом видео. Затем разведите стрептавидин, или стоковый раствор SAV, до 0,4 миллиграмм на миллилитр, и равномерно нанесите его на стеклянные поверхности так, чтобы образовался тонкий слой. После инкубации стакана в течение 18-24 часов используйте 150 микролитров PBS для трех промывки каждой поверхности.

Затем смочите бумажное полотенце деионизированной водой и положите его в 14-сантиметровую чашку Петри, окружающую пластины, чтобы сохранить влагу в лунках. Накройте чашку Петри стеклянными поверхностями и поместите ее в холодильник с температурой биобезопасности 1 при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока это не понадобится. Чтобы осуществить захват клеток, необходимо аспирировать среду из колб Т175 клеток.

Затем используйте PBS для промывки клеток и аспирации буфера. Добавьте в колбу 10 миллилитров неферментативного лифтинга, такого как раствор для диссоциации клеток. Затем выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести минут.

Через шесть минут добавьте 10 миллилитров холодного HBSS, чтобы разбавить лифтер. Затем пипеткой набирают 20 микролитров клеток и с помощью гемоцитометра подсчитывают их. Центрифугируйте клеточную суспензию при температуре 500 x g, в четырех градусах Цельсия, в течение пяти минут.

И использовать HBSS для ресуспендирования клеток до одного умноженного на 10 до шестой клетки на миллилитр. Проводите пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать клетки в растворе и уменьшить слипание клеток, что может снизить связывание антител. Затем расщепляют клеточную суспензию на отдельные контрольные и экспериментальные растворы.

Добавьте биотинилированные антитела к растворам соответствующих клеток и инкубируйте в миксере при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут. Используйте 150 микролитров HBSS для трехкратной промывки функционализированного стекла в восьмилуночных планшетах, как было продемонстрировано ранее в видео. Добавьте раствор клеток в лунки, и выдерживайте на льду в шейкере в течение 45 минут.

Тем временем приготовьте 20 миллимолярный раствор биотина в стерильном HBSS. Затем, после инкубации, аккуратно с помощью 150 микролитров HBSS смыть клеточный раствор со стекла. Повторив промывку еще два раза, добавьте по 150 микролитров раствора биотина в каждую соответствующую высвобождающую лунку и инкубируйте в течение 20 минут, чтобы дать протекать реакции.

Соберите неспецифически связанные клетки, используя HBSS для промывания клеток. Затем приступайте к флуоресцентной визуализации и анализу в соответствии с текстовым протоколом. Включите изображения живых клеток в колбе в качестве контроля.

В этом эксперименте MCF7GFP клетки подвергались воздействию функционализированной поверхности. 60% клеток были захвачены с помощью антитела HLA-ABC. При воздействии 20 миллимолярного биотина высвобождалось 80% захваченных клеток.

Как показано здесь, когда MCF7GFP клетки были смешаны с клетками RAW 264.7, было захвачено 50% макрофагов RAW, а добавление 20 микромолярного биотина впоследствии высвободило 80% захваченных RAW-клеток. Этот рисунок показывает, что макрофаги положительного контроля RAW не проявляют флуоресцентной активности. Тем не менее, отрицательные контрольные MCF7GFP клетки положительны на флуоресценцию GFP.

Поскольку избыток антител может снизить захват клеток, концентрация антител была оптимизирована путем титрования от нуля до 10 000 нанограммов на миллилитр антитела HLA. Результаты показали, что идеальная концентрация антител составляла от 100 до 1000 нанограммов на миллилитр. Кроме того, эксперименты по оптимизации клеток определили, что идеальная концентрация клеток, которые могут быть захвачены, составляет от 1 до 10 к пятой и от 1 до 10 до шестой клетки, поскольку величины ниже этого числа ниже фона.

После освоения эта техника может быть выполнена за три дня, менее чем за шесть часов экспериментального времени, не считая ночных инкубаций. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о сборе размывов клеток во время экспериментов, так как они могут дать жизненно важную информацию об эффективности поверхности. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как проточная цитометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие уровни экспрессии рецепторов могут иметь интересующие клетки.

После своего развития функционализация поверхности проложила путь исследователям в области биоматериалов к изучению биобезопасной интеграции материалов, таких как имплантаты, у пациентов с различными заболеваниями и травмами. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как функционализировать поверхность стеклянных поверхностей для захвата и высвобождения интересующих клеток, что позволяет проводить последующий анализ. Не забывайте, что работа с живыми клетками в азиде натрия может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как надлежащая подготовка, СИЗ и утилизация.