Непрерывный волновой тулиевый лазер для нагревательных клеток, предназначенных для исследования клеточных тепловых эффектов

Общая цель этой процедуры заключается в изучении термических дозозависимых биологических реакций клеток in vitro путем нагревания культивируемых клеток с точным контролем температуры и времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в областях, изучающих реакцию клеток или тканей на гипертермию, таких как изучение лазерного лечения сетчатки. Основным преимуществом данной методики является быстрый нагрев ячеек и точный контроль продолжительности нагрева, что позволяет получить высокую воспроизводимую тепловую экспозицию во время экспериментов.

Хотя этот метод может дать представление о реакции культивируемых пигментных эпителиальных клеток сетчатки на тепловое лазерное излучение, он также может быть применен к другим моделям, таким как раковые клетки. Впервые идея этого метода пришла нам в голову при нагревании клеток, содержащих меланин, видимым лазерным светом. Однако это приводило к изменению температурных профилей из-за вариаций пигментации.

Чтобы начать процедуру, поместите нагревательную плиту в регулируемую металлическую лабораторную подставку на чистом столе. Установите конфорку на 39 градусов Цельсия. Закрепите волокно 0,22 NA с диаметром сердцевины 365 микрометров на горизонтальном кронштейне подставки.

Расположите металлический кронштейн над нагревательной пластиной и отрегулируйте подставку так, чтобы кончик волокна находился на 12 сантиметров выше нагревательной пластины. Подключите 1,94-микрометровый 20-ваттный тулиевый лазер с 365 нанометровым прицельным лучом мощностью один милливатт к кончику волокна. Поставьте на конфорку чашку для культуры диаметром 30 миллиметров.

Тщательно обведите окружность блюда по поверхности горячей плиты, а затем снимите блюдо. Включите прицельный луч и отрегулируйте подставку так, чтобы центр пятна луча на горячей пластине совпал с нарисованным кругом. Затем выключите прицельный луч.

Чтобы начать процедуру калибровки температуры, нагрейте кончик стрелки 20 калибра с помощью горелки Бунзена. Нагретым кончиком иглы проткните чашку для культуры диаметром 30 миллиметров близко ко дну в четырех точках на расстоянии 90 градусов друг от друга, чтобы сделать отверстия диаметром около 300 микрометров. Наклейте на отверстия изоленту.

С помощью тонкой иглы проделайте отверстие диаметром примерно 200 микрометров через ленту, закрывающую каждое отверстие. На нижней стороне чашки для культуры проведите линию между каждой парой отверстий на расстоянии 180 градусов друг от друга. Начиная с пересечения линий, отметьте каждые три миллиметра радиально вдоль каждой линии, чтобы обозначить 21 точку измерения.

Затем поместите в посуду ровно 1,2 миллилитра предварительно подогретой до 37 градусов Цельсия свежей питательной среды. Накройте блюдо крышкой и установите блюдо по наведенному кругу на конфорку. Подключите термопару диаметром 200 мкм к компьютеру управления лазером и откройте протокол калибровки температуры.

Вставьте термопару в одно из отверстий в чашке так, чтобы наконечник находился на дне чашки в одном из мест отметки. Очень важно проверить, касается ли кончик термопары дна посуды с измеренной точностью, потому что температура может варьироваться в зависимости от глубины. Подождите, пока культуральная среда стабилизируется на уровне 37 градусов Цельсия.

Затем включите тулиевый лазер и установите мощность лазера на нужный стартовый уровень. Убедитесь, что продолжительность предварительного нагрева установлена на 140 секунд и восемь секунд, а затем начните последовательность предварительного облучения подогревом. Через 140 секунд после звукового сигнала немедленно снимите крышку чашки для культивирования.

Подождите, пока закончится предварительный нагрев и произойдет 10-секундное облучение. Затем сразу же накройте блюдо крышкой. Таким образом измерьте температуру в точках на 21 отметке.

Выполните эту процедуру три раза каждый раз с интервалом в три ватта, охватывающим диапазон мощности лазера. Закончив, выключите тулиевый лазер. Экспорт и анализ данных о температуре.

Перед началом эксперимента культуру арендовали пигментные эпителиальные клетки в чашках для культуры диаметром 30 диаметра. Поддерживайте клеточные культуры при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5% и проверяйте их с помощью системы визуализации живых клеток. За час до облучения замените питательную среду в каждой чашке ровно 1,2 миллилитрами свежей питательной среды.

Верните культуры в инкубатор. Убедитесь, что станция облучения готова и что конфорка установлена на 39 градусов Цельсия. Когда вы будете готовы начать облучение, запустите тулиевый лазер с желаемой мощностью.

Откройте протокол эксперимента и убедитесь, что продолжительность предварительного нагрева установлена на 140 и восемь секунд. Поместите культуру клеток РПЭ в закрытую чашку в отмеченном месте на горячей плите и немедленно начните последовательность предварительного облучения 140 и 8 секунд. Снимите крышку посуды после 140 секунд предварительного нагрева.

Подождите, пока закончится предварительный нагрев и произойдет 10-секундное облучение. Сразу же накройте посуду крышкой, подождите семь секунд, а затем верните чашку в инкубатор. Облучайте дополнительные образцы с возрастающими уровнями мощности лазера.

Когда закончите, выключите тулиевый лазер. Чтобы начать оценку жизнеспособности клеток, промойте облученные клетки PBS. Получите набор, способный дифференцировать живые апоптотические и некротические клетки.

Затем при слабом освещении смешайте 500 микролитров связывающего буфера с 25 микролитрами гомодимера-3 этидия, аннексином FITC и Hoechst 33342. Инкубируйте клетки в этом окрашивающем растворе при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем дважды промойте ячейки связывающим буфером 1X.

Замените связывающий буфер на PBS и поместите ячейку на предметное столико флуоресцентного микроскопа с фильтрами DAPI, FITC и TRITC. Установите путь света микроскопа к линзе глаза и выберите фильтр DAPI. Включите подсветку и найдите плоскость фокусировки с объективом 4X.

Задайте путь света к камере микроскопа. Используйте программное обеспечение для визуализации микроскопа для центрирования и фокусировки изображения. Определите параметры для получения изображений с помощью фильтра DAPI.

Повторите процесс фокусировки и получения изображения с помощью фильтров FITC и TRITC. Затем используйте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы получить несколько изображений с помощью трех наборов фильтров по всему блюду и объединить их в одно изображение всего блюда для культуры. Используйте аналитическое программное обеспечение для определения температурных порогов для апоптоза и гибели клеток.

Пропорциональная зависимость между максимальным повышением температуры в центре чашки для клеточных культур и мощностью лазера определялась с помощью описанной процедуры термокалибровки. Максимальное распределение температуры по чашке для клеточных культур затем было подогнано к гауссовой функции. После облучения наблюдались три рисунка окрашивания.

Не наблюдалось никаких изменений жизнеспособности в культурах, подвергавшихся воздействию температур при температуре 43 градуса Цельсия или ниже. Апоптоз впервые наблюдался через три часа после облучения при температуре 47 градусов по Цельсию. Гибель клеток наблюдалась позже, чем через три часа после 51 градуса Цельсия и выше.

Средние пороговые температуры для апоптоза и гибели клеток были затем определены путем применения среднего значения измеренных радиусов мертвых и апоптотических областей к функции Гаусса, описывающей распределение температуры. После этой процедуры облучение может быть выполнено в различных условиях, таких как различные профили лазера, размеры пятен и время облучения. Это может помочь понять и исследовать вопросы, связанные с индивидуальными временными причинами температуры на клеточном уровне.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как нагревать клеточную культуру с хорошим контролем температуры и времени. Это может быть связано с возможностями изучения биологических реакций на различные условия теплового облучения. Не забывайте, что работа с лазерами может быть очень опасной для ваших глаз и кожи.

Будьте в курсе курсов по технике безопасности при лазерном облучении. При выполнении этой процедуры всегда надевайте соответствующие защитные очки, лабораторный халат и перчатки.