Изготовление Перевернутый коллоидный кристалл поли (этиленгликоль) строительные леса: трехмерная Cell Culture платформа для печени тканевой инженерии

Общая цель данной процедуры заключается в изготовлении каркасов на основе инвертированного коллоидного кристалла из ПЭГ с внеклеточным матриксом для применения в инженерии тканей печени. Инженерия тканей печени является перспективной областью тканевой инженерии и регенеративной медицины. Мы создаем трехмерный инженерный каркас, который позволяет клеткам печени сохранять свою функцию в течение длительного времени.

Значение данной методики распространяется на тестирование лекарственных препаратов, поскольку клетки печени, культивируемые с помощью этой системы, могут дольше сохранять свою функцию и лучше реагировать на препараты. Хотя этот метод позволяет глубже понять принципы тканевой инженерии, его также можно применять к другим системам, например, использующим стволовые клетки. Процедуру продемонстрирует Хитоми, аспирантка моей лаборатории.

Для подготовки форм для микросфер сначала обрежьте кончики термостойких микроцентрифужных пробирок объемом 0.2 миллилитра на уровне 40 µL. С помощью водостойкого клея прикрепите верхние части обрезанных пробирок к предметным стеклам микроскопа, после чего заклейте область вокруг форм. Затем замените воду в флаконе с полистирольными микросферами на 70% этанол.

Поместите раствор сфер в ультразвуковую баню и подвергните смесь воздействию ультразвука при мощности 30 ватт в течение трех минут, чтобы разрушить агрегаты сфер. После подготовки микросфер внесите по 100 мкл этанола в каждую из форм. Затем отрежьте 4 мм от верхней части наконечника дозатора на 200 мкл и с его помощью дважды внесите по 25 мкл полистирольных микросфер в форму.

Поместите формы на качающий шейкер и установите скорость 120 RPM. Оставьте образцы на шейкере на ночь. На следующий день поместите формы под микроскоп и убедитесь, что сферы расположены в гексагональном порядке.

Дайте этанолу испариться при комнатной температуре в течение двух ночей. После этого осторожно поместите комплекс из формы и микросфер в печь при температуре 130 °C на шесть часов для отжига полистирольных микросфер и формирования негатива 3D-каркаса. Сначала синтезируйте макромеры диакрилата полиэтиленгликоля, используя общепринятые протоколы, описанные в этих двух источниках.

Затем приготовьте 50% раствор PEGDA в деионизированной воде и центрифугируйте смесь до полного растворения. Для скаффолдов, конъюгированных с внеклеточным матриксом, добавьте в 50% раствор PEGDA дополнительно 10% PEG NHS крилевого масла. Затем приготовьте 20% стоковый раствор фотоинициатора в 70% этаноле.

Добавьте 50 мкл раствора фотоинициатора на каждый миллилитр смеси PEGDA. Затем перемешайте смесь на вортексе в течение одной минуты. После этого снимите формы со стеклянных предметных стекол, осторожно вытолкните решетки с помощью шпателя и поместите их в отдельные центрифужные пробирки объемом 1,5 мл.

Перенесите пипеткой 300 µL раствора PEGDA в каждую пробирку, затем центрифугируйте пробирки, чтобы раствор PEGDA проник в полистирольную решетку. Затем извлеките решетку из пробирки с помощью пинцета и аккуратно удалите излишки раствора PEGDA с поверхности. Поместите решетку плоской круглой поверхностью вверх на стекло, покрытое парафиновой пленкой.

Затем подвергните каркас воздействию ультрафиолетового света с длиной волны 365 нанометров в течение пяти минут, используя УФ-точечную лампу. Поместите около десяти полимеризованных кристаллических решеток из PEGDA в новый флакон и добавьте 20 миллилитров THF. Перемешивайте флаконы на орбитальном шейкере при 300 RPM в течение шести часов.

Каждые один-два часа извлекайте флакон и заменяйте растворитель, содержащий полимер, свежим THF. После последнего промывания добавьте воду в использованный раствор THF, чтобы проверить, полностью ли растворились сферы PS. Если раствор белый, проведите дополнительные промывки до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

Для стерилизации скаффолдов подготовьте микроцентрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, налейте в нее 2 мл 70% этанола на каждый скаффолд и поместите скаффолды в пробирку с помощью шпателя. Оставьте скаффолды замачиваться в этаноле на один час. Через час осторожно слейте этанол и замените его равным объемом стерильного PBS.

Затем центрифугируйте скаффолды, чтобы удалить пузырьки воздуха. Храните центрифугированные скаффолды при температуре четыре градуса Цельсия, извлекая их каждые один-два часа для замены раствора на свежий PBS. После нескольких замен PBS извлеките скаффолды для нанесения коллагенового покрытия и поместите их в пробирку, содержащую один миллилитр коллагена I типа на каждый скаффолд, подлежащий покрытию.

Затем центрифугируйте пробирку, как и раньше, после чего встряхивайте каркасы при 400 об/мин на орбитальном шейкере в течение 30 минут. Храните каркасы в течение ночи при температуре 4 °C. Культивируйте клетки гепатокарциномы в чашках для культивирования клеток диаметром 100 мм с 10 мл культуральной среды.

Меняйте среду каждые три дня, пока плотность клеток не достигнет 75–80% площади поверхности культуры. Когда клетки будут готовы, осторожно поместите скаффолды плоской поверхностью вверх в 24-луночный планшет. Затем промойте каждый скаффолд двумя миллилитрами PBS.

Отоберите PBS и добавьте два миллилитра ростовой среды к скаффолдам. Через 30 минут удалите среду и дайте скаффолду высохнуть в течение одного часа. Затем соберите клетки гепатокарциномы, используя метод трипсинизации.

После осаждения клеток удалите супернатант и ресуспендируйте осадок таким образом, чтобы концентрация составляла один миллион клеток на 25 µL. Медленно перенесите пипеткой 25 µL клеточной суспензии непосредственно на каждый скаффолд. Затем накройте планшет и поместите его в инкубатор на ночь.

Затем осторожно перенесите скаффолды в новый 24-луночный планшет и дозируйте по два миллилитра среды в каждую лунку, после чего верните планшет в инкубатор. Здесь представлено изображение скаффолда, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа. Он состоит из гексагональной плотноупакованной структуры пор со средним диаметром от 100 до 105 microns, которые образуют взаимосвязи с соседними порами, диаметр которых составляет преимущественно от 35 до 40 microns.

При посеве клеток гепатокарциномы они растут и пролиферируют на скаффолдах, предварительно покрытых коллагеном 1-го типа, но не увеличиваются в количестве на незащищенных скаффолдах. Кроме того, клетки гепатокарциномы на скаффолдах с коллагеновым покрытием продемонстрировали более высокую клеточную функцию, зависящую от концентрации. На 14-й день клетки гепатокарциномы, культивируемые на скаффолдах ICC с покрытием 400 µg/mL, секретировали в более чем три раза больше альбумина, чем клетки, культивируемые на незащищенном скаффолде.

При выполнении данной процедуры важно следить за тем, чтобы полистирольные сферы в решетке были расположены правильно. Неправильное расположение приведет к плохой взаимосвязи, что может отрицательно сказаться на активности клеток. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изготавливать целлюляризованные инвертированные коллоидные кристаллические каркасы на основе ПЭГ с покрытием.

Не забывайте, что работа с тетрагидрофураном может быть опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу, использование перчаток и защитных очков.