Высокая пропускная способность гена Tagging в
12 августа 2016 г.
Добавление метки к белку — это мощный способ получить представление о его функции. В этой статье мы описываем протокол эндогенной маркировки сотен белков Trypanosoma brucei параллельно, чтобы можно было достичь мечения на уровне генома.
Общая цель данного метода заключается в высокопроизводительном мечении белков у Trypanosoma brucei. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области изучения кинетоплагид относительно локализации и потенциальной функции больших групп белков. Основным преимуществом данной методики является возможность быстрого и легкого параллельного мечения большого количества белков.
Хотя данный метод позволяет получить представление о локализации, взаимодействие больших групп белков также можно исследовать с помощью других меток. Например, метки BirA для экспериментов по картированию сближения методом Bio-ID. Процедуру продемонстрирует Росс Мадден, лаборант-исследователь из нашей лаборатории.
Перед началом данной процедуры предварительно заморозьте 96-луночный ПЦР-охладитель в морозильной камере при температуре −80 °C. Приготовьте Master Mix A, смешав в пробирке объемом 10 мл следующие компоненты: 100 µL дистиллированной деионизированной воды, 105 µL DMSO ПЦР-класса, 105 µL 10 мM dNTPs и 105 µL матрицы pPOT.
Налейте Master Mix A в резервуар для реагентов и распределите по 23 µL Master Mix A в каждую лунку 96-луночного PCR-планшета. С помощью 12-канального многоканального дозатора P20 добавьте по 2 µL смеси праймеров с концентрацией 100 µM в каждую заполненную лунку. Герметично закройте планшет пленкой.
Поместите его в предварительно охлажденный блок-охладитель для ПЦР и выдержите в замороженном состоянии не менее 20 минут при температуре −80 °C. Замораживание мастер-микса для ПЦР A критически важно для обеспечения эффективной реакции с «горячим стартом», даже при использовании специфической полимеразы с «горячим стартом». Это позволяет добиться воспроизводимой и высокопродуктивной амплификации.
Пока ПЦР-планшет находится в морозильной камере, приготовьте мастер-микс B. Смешайте в пробирке объемом 10 мл следующие компоненты: 2 048 µL дистиллированной деионизированной воды, 525 µL 10X буфера и 52,5 µL полимеразы, чтобы получить общий объем 2 626 µL на один планшет. Извлеките ПЦР-планшет и ПЦР-охладитель из морозильной камеры при -80 °C.
Не снимая планшета с охлаждающего устройства для ПЦР, быстро добавьте 25 µL Master Mix B поверх замороженного Master Mix A в каждую лунку, чтобы общий объем реакции составил 50 µL. Это критически важный по времени этап, который должен быть завершен до того, как Master Mix A успеет разморозиться. Загерметизируйте планшет пленкой.
Настройте амплификатор следующим образом: 94 °C в течение 10 минут, затем 30 циклов: 94 °C в течение 15 секунд, 65 °C в течение 30 секунд и 72 °C в течение двух минут, после чего следует этап финальной элонгации при 72 °C в течение семи минут. После того как блок достигнет 94 °C, установите ПЦР-планшет в амплификатор и запустите программу амплификации.
Начните выполнение данной процедуры с приготовления большого 1% агарозного геля в буфере для электрофореза Tris-acetate EDTA или TAE с четырьмя рядами лунок. Внесите маркер ДНК размером 1 kb в первую и 28-ю лунки каждого ряда. Следующий шаг заключается в переносе двух микролитров ПЦР-продукта непосредственно, без добавления буфера для нанесения ДНК, в каждую дорожку геля в соответствии с представленной здесь схемой.
Например, продукты ПЦР из рядов A и B ПЦР-планшета вносятся в нечетные и четные лунки первого ряда геля соответственно. Чтобы снизить вероятность контаминации ампликонов, быстро внесите продукты ПЦР из ряда A ПЦР-планшета в нечетные лунки первого ряда геля. Затем внесите продукты ПЦР из ряда B ПЦР-планшета в четные лунки первого ряда геля.
Загрузите продукты ПЦР из рядов C и D ПЦР-планшета по этой же схеме: образцы из ряда C — в лунки с нечетными номерами, а образцы из ряда D — в лунки с четными номерами второго ряда геля. Продолжайте загрузку по этой схеме, пока все лунки ПЦР-планшета не будут перенесены на гель. Поместите гель в электрофоретическую камеру и заполните ее рабочим буфером TAE так, чтобы гель был полностью погружен.
Проводите электрофорез при напряжении 100 В в течение 30 минут. Визуализируйте результат с помощью УФ-трансиллюминатора. Здесь представлен типичный агарозный гель для валидации ПЦР в 96-луночном формате, где 95 из 96 ПЦР прошли успешно.
Неудачной ПЦР была проба H11. В данной процедуре используется клеточная линия SMOXP9 проциклических форм Trypanosoma brucei. Вырастите клетки до соответствующей плотности, как описано в тексте протокола, и соберите необходимое количество клеток путем центрифугирования при 800 ×g в течение 10 минут.
Начните подготовку к электропорации, пока клетки центрифугируются. Подключите манипулятор для планшетов к электропоратору. На блоке электропоратора установите напряжение 1 500 вольт, длительность импульса 100 микросекунд, количество импульсов 12 и интервал между импульсами 500 миллисекунд.
На манипуляторе планшетов установите количество импульсов, равное одному. С помощью 12-канального многоканального дозатора P200 перенесите ПЦР-реакции из ПЦР-планшета в одноразовый 96-луночный планшет для электропорации. Промойте клетки в 10 миллилитрах модифицированного цитомикса и снова центрифугируйте при 800 ×g в течение 10 минут.
Ресуспендируйте клетки в 23 миллилитрах модифицированного cytomix до конечной концентрации 5 × 10⁷ клеток на миллилитр. Перенесите клеточную суспензию в резервуар для реагентов. Добавьте по 200 мкл клеточного раствора в каждую лунку планшета для электропорации и перемешайте с ПЦР-продуктом с помощью пипетирования.
С помощью салфетки удалите все капли с верхней части планшета, чтобы избежать короткого замыкания. Наклейте герметизирующую пленку на верхнюю часть планшета для электропорации, расположив ее так, чтобы отверстия для электродов в верхней и нижней частях каждого столбца оставались открытыми. Избегайте перекрытия выступающих точек, которые служат направляющими для пленки.
Поместите планшет для электропорации в манипулятор для планшетов и закройте крышку. Нажмите кнопку «pulse» на блоке электропоратора. После электропорации клетки необходимо быстро перенести в четыре 24-луночные планшета для культивирования тканей, содержащие по 1 мл среды SDM-79 в каждой лунке для восстановления.
Используйте 12-канальный многоканальный дозатор P200, удалив каждый второй наконечник так, чтобы оставшиеся шесть наконечников совпадали с шестью рядами 24-луночного планшета для культивирования тканей. После переноса клеток из 96-луночного планшета в 24-луночный промойте лунки 96-луночного планшета средой из соответствующих лунок 24-луночного планшета. Затем перенесите промывочную жидкость обратно в лунки 24-луночного планшета.
Перенесите электропорированные клетки из 96-луночного планшета для электропорации в 24-луночные планшеты для культивирования тканей согласно заранее определенной схеме, показанной здесь. Например, клетки из лунок с нечетными номерами ряда A 96-луночного планшета переносят в ряд A планшета A, а клетки из лунок с четными номерами ряда A 96-луночного планшета — в ряд A планшета C. После каждого переноса клеток из 96-луночного планшета в 24-луночный промойте лунки в 96-луночном планшете средой из соответствующего ряда 24-луночного планшета. Затем перенесите промывочную жидкость обратно в 24-луночный планшет.
Перенос клеток в 24-луночные планшеты может быть затруднительным, однако необходимо обеспечить возможность соотнести полученные клеточные линии с соответствующим ID гена. Критически важно выполнить этот этап быстро, чтобы сохранить жизнеспособность клеток. После переноса всех электропорированных клеток в четыре 24-луночные планшета поместите их в чистый пластиковый контейнер с плотно закрывающейся крышкой. Поместите контейнер в инкубатор при температуре 28 °C.
Через шесть–восемь часов добавьте в каждую лунку по одному миллилитру среды SDM-79 с 10% FCS, содержащей селективный антибиотик. Инкубируйте при 28 °C от девяти до 10 дней, пока не станут видны трансгенные клеточные линии. После проведения трансфекции в 96-луночном планшете для мечения 96 различных белков на концевом терминале клетки переносятся в 24-луночные планшеты для культивирования тканей для восстановления и селекции.
Затем каждую лунку оценивают, чтобы определить, содержит ли она жизнеспособные устойчивые к препарату клетки. В жизнеспособной лунке преобладают высокоактивные клетки, которые выглядят яркими при фазово-контрастной микроскопии. На данной схематической иллюстрации зеленым цветом обозначена лунка с успешной трансфекцией, а серым — лунка, содержащая только погибшие клетки.
88 из 96 лунок, или 92%, содержат успешно трансфекционированных паразитов после 15 дней селекции. После освоения методики процесс от подсчета клеток до их высева после электропорации займет примерно один час. При выполнении данной процедуры важно не забыть добавить селективные препараты через шесть-восемь часов после трансфекции.
После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как проводить маркировку больших групп белков у Trypanosoma brucei.
Обзор
В данной статье представлен высокопроизводительный метод мечения белков в Trypanosoma brucei, позволяющий изучать их локализацию и функцию. Описанный протокол обеспечивает параллельное мечение сотен белков, что способствует проведению масштабных геномных исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Геномика
Теоретические сведения
- Маркировка белков имеет важное значение для понимания их функций.
- Trypanosoma brucei является модельным организмом для изучения кинетопластид.
- Высокопроизводительные методы повышают эффективность исследований белков.
- Маркировка позволяет выявить локализацию и динамику взаимодействий белков.
Цель исследования
- Разработать протокол эндогенного мечения белков у T. brucei.
- Обеспечить возможность исследования локализации и функций белков.
- Реализовать возможность широкомасштабного геномного мечения для проведения комплексных исследований.
Используемые методы
- Приготовление мастер-миксов для ПЦР-амплификации.
- Электропорация клеток T. brucei конструктами с метками.
- Валидация продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле.
- Использование специфических меток для изучения белок-белковых взаимодействий.
Основные результаты
- Успешное мечение большой когорты белков T. brucei.
- Высокий выход и воспроизводимость ПЦР-амплификации.
- Подтвержденная возможность проведения высокопроизводительных исследований белков.
- Валидация метода посредством успешных результатов ПЦР.
Выводы
- Разработанный протокол позволяет эффективно осуществлять мечение белков в T. brucei.
- Данный метод может значительно продвинуть исследования в области кинетопластид.
- В будущих исследованиях эту методику можно использовать для более глубокого изучения функций белков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Высокопроизводительное мечение белков позволяет проводить систематическую функциональную аннотацию протеомов патогенов, что способствует снижению рисков при выборе мишеней на ранних этапах разработки противопаразитарных препаратов. Благодаря созданию библиотек меченых белков на основе эндогенных локусов, данный метод обеспечивает получение количественных данных о локализации и взаимодействиях, необходимых для приоритизации доступных для воздействия мишеней в рамках разработки лекарств против забытых болезней. Масштабируемость данного подхода соответствует инициативам по общегеномному скринингу, ускоряя циклы от выдвижения гипотезы до ее подтверждения в рабочих процессах валидации мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем эндогенного мечения белков патогена для определения их локализации и картирования взаимодействий.
- Практическая ценность: облегчает параллельное мечение от десятков до сотен кандидатов, что увеличивает пропускную способность при отборе мишеней и последующем фенотипическом скрининге.
- Прогностическая ценность: способствует снижению механистических рисков за счет получения воспроизводимых данных о субклеточной локализации и коиммунопреципитации для больших когорт генов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать валидированные клеточные линии, экспрессирующие меченые белки, что обеспечивает возможность проведения стандартизированных анализов связывания, локализации или функционального анализа.
- Практическая ценность: Электропорация в 96-луночном формате обеспечивает стабильную доставку ДНК-конструкций, что повышает воспроизводимость на платформах для скрининга на основе трансфекции.
- Масштабируемость: Восстановление клеток в 24-луночных планшетах способствует клональной изоляции и селекции, создавая возобновляемый ресурс для последующих кампаний по валидации мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Линии с мечеными белками позволяют соотнести молекулярные фенотипы с чувствительностью к препаратам, что способствует созданию доклинических моделей, согласованных с биомаркерами.
- Механистическое понимание: Облегчает идентификацию белковых комплексов и путей, помогая понять механизм действия и механизмы резистентности.
- Достоверность мишени: Эндогенное мечение сохраняет нативные уровни экспрессии, что снижает количество артефактов и повышает прогностическую значимость при оценке существенности мишени.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод соответствует фазе поисковой биологии, в которой высокопроизводительное мечение способствует идентификации и валидации мишеней перед оптимизацией соединений-лидеров. Он позволяет создавать клеточные линии, готовые к использованию в качестве реагентов для биохимического и клеточного анализов, обеспечивая переход от геномных хитов к функциональной валидации. Такие результаты, как паттерны локализации и сети взаимодействий, служат основой для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) при приоритизации мишеней.
- Биология открытий: обеспечивает проверку гипотез посредством определения субклеточной локализации и идентификации партнеров по взаимодействию для генов-кандидатов, отобранных в ходе геномного скрининга.
- Скрининг: позволяет подготавливать стандартизированные меченые клеточные линии для разработки воспроизводимых анализов в каскадах валидации мишеней.
- Аналитика: позволяет получать данные количественной визуализации и образцы, готовые для протеомного анализа, для сравнения локализации, экспрессии и состояний взаимодействия при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывают валидацию молекулярных мишеней с фенотипическими результатами с помощью меченых линий, применимых в исследованиях лекарственного ответа и резистентности.
- Корпоративное повторное использование: система плазмид и праймеров adaptable для различных наборов генов, что позволяет использовать её в нескольких проектах без перепроектирования основных компонентов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишеней за счет эндогенного параллельного тегирования, сохраняющего нативный контекст и функцию белка.
- Операционная ценность: Стандартизированный рабочий процесс электропорации и селекции в 96-луночных планшетах повышает воспроизводимость и сокращает время непосредственной работы с каждой мишенью.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает быстрое масштабирование усилий по валидации мишеней, повышая эффективность использования капитала на ранних этапах поиска за счет снижения процента неудач на поздних стадиях из-за недостаточно валидированных мишеней.
- Влияние на портфель: Поддерживает продвижение проектов с учетом рисков, предоставляя многопараметрические данные (локализация, взаимодействия, экспрессия) для обоснованного ранжирования мишеней.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области молекулярной биологии по дизайну праймеров для ПЦР, клонированию и методам культивирования трипаносом.
- Необходимо наличие систем электропорации, совместимых с планшетами на 96 лунок, и использование стандартизированных параметров импульса.
- Требуются стандартизированные протоколы антибиотического отбора и восстановления для обеспечения стабильного восстановления трансгенных линий во всех лунках планшета.
- Адаптация к другим типам меток (например, флуоресцентным, аффинным, меткам близости) требует валидации функциональности метки и ее совместимости с последующими анализами.
- Успех зависит от тщательного отслеживания соответствия лунки и гена на этапах переноса для сохранения связи между генотипом и фенотипом.
