Обонятельные Поведения, испытываемых Computer Отслеживание
20 августа 2016 г.
Мы описываем здесь поведенческую установку и метод анализа данных для анализа обонятельных реакций до 100 уксусных мух (Drosophila melanogaster). Эта система может быть использована с одним или несколькими обонятельными стимулами и адаптирована для оптогенетической активации или подавления нейрональных субпопуляций.
Общая цель данной установки заключается в анализе обонятельного поведения мух в четырехквадрантном ольфактометре с использованием прилагаемого программного скрипта для автоматизированного отслеживания мух. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о том, как обонятельные нейронные системы воспринимают внешний мир и как мозг декодирует информацию и определяет поведенческие решения. Основным преимуществом данной методики является ее универсальность и надежность, что позволяет проводить повторное тестирование обонятельных реакций популяции мух в большой экспериментальной арене.
Для данного протокола подготовьте пять камер для пахучих веществ, которые состоят из внешнего пластикового контейнера, внутреннего стеклянного контейнера и специально изготовленной вставки из ПТФЭ для крышки. Вставка представляет собой оригинальную крышку контейнера с удаленной центральной частью и двумя прикрепленными односторонними клапанами. Используйте четыре камеры для контроля растворителем и одну камеру для исследуемого пахучего вещества.
Убедитесь в чистоте каждой камеры, затем наполните контейнер с одорантом 1 mL растворителя или разбавленного одоранта. После этого проверьте положение контейнера в пластиковой камере и убедитесь в отсутствии проливов жидкости. Плотно закройте крышку с помощью винтового колпачка и уплотнительного кольца на ПТФЭ-вставке для предотвращения утечек.
Выращивайте мух на стандартной кукурузной среде. В стандартный флакон поместите 30 самцов и 30 самок и оставьте их для откладки яиц на пять дней при комнатной температуре. Из таких флаконов соберите только что вылупившихся мух.
Для каждой экспериментальной когорты отберите по 25 самцов и 25 самок мух при кратковременной анестезии углекислым газом и оставьте когорту стареть на стандартной питательной среде для мух в течение двух-четырех дней. За 40–42 часа до начала эксперимента перенесите когорту в виалу с примерно 10 миллилитрами одного процента агарозного геля для поддержания влажности без корма. Голодание способствует увеличению общей двигательной активности; при этом более 90% мух должны пережить процесс голодания.
Если погибает более 10% особей, что может произойти при слабом генотипе, попробуйте подвергнуть всех мух в эксперименте однодневному голоданию. Минимум за пять минут до начала включите контроллер температуры и установите значение 25 °C. Затем соедините камеры с одорантом с ареной с помощью пластической трубки.
Проверьте скорость воздушного потока в каждом квадранте арены с помощью электронного расходомера. Убедитесь, что потоки контрольного воздуха и воздуха с одорантом проходят со скоростью 100 milliliters per minute. Мухи очень чувствительны к воздушному потоку, поэтому крайне важно проверять его в каждом квадранте перед каждым экспериментом.
Теперь очистите арену и стеклянные пластины, используя 70% ethanol. Протрите все детали два или три раза и дайте им полностью высохнуть на воздухе перед тем, как продолжить. Затем закрепите стеклянные пластины на арене с помощью зажимов.
Затем перенесите мух в арену без использования анестезии. Позвольте им попасть внутрь через отверстие в одной из стеклянных пластин под действием силы тяжести, после чего закройте отверстие круглой сеткой. Теперь поместите арену с мухами в светонепроницаемую камеру.
Затем подсоедините четыре контрольных потока воздуха к каждому углу арены. Закройте дверь камеры и дайте мухам акклиматизироваться в новой среде в течение 10–15 минут. После периода акклиматизации проведите контрольный эксперимент продолжительностью от 5 до 10 минут, в ходе которого мухи подвергаются воздействию четырех контрольных потоков воздуха.
Теперь необходимо незамедлительно проанализировать данные. Если мухи распределены по арене неравномерно, арену следует перенастроить. Критически важно протестировать поведение контрольных мух в условиях подачи только чистого воздуха.
Это позволит быстро убедиться, что все фоновые условия в норме. Проблемы могут вызвать утечка света, температурный дисбаланс, наклон арены или загрязнение посторонними запахами. При необходимости удалите мух и повторно очистите арену.
При подозрении на загрязнение одорантом замените все трубки. Продолжайте повторять контрольный тест с новыми когортами до тех пор, пока животные не перестанут проявлять предпочтение к любому из четырех квадрантов. Затем с помощью трехходового крана подключите камеру с исследуемым одорантом к установке или заново подсоедините трубки и проведите тестовый эксперимент в течение 5–10 минут.
При проведении длительных экспериментальных записей быстро останавливайте и перезапускайте программу трекинга каждые 20 минут, иначе файлы данных станут слишком большими. Между тестами утилизируйте мух, очистите арену и стеклянные пластины 70% ethanol и замените соединительные трубки. Поддерживайте постоянный поток сухого воздуха для непрерывной продувки системы.
Для повышения эффективности рекомендуется использовать две арены, чтобы очистку можно было проводить во время проведения опытов. Если в течение одного дня несколько экспериментов были проведены ошибочно, следует уделить особое внимание тому, чтобы в системе не осталось запахов от предыдущего запуска. Обычно это не представляет проблемы при низких концентрациях одоранта или при использовании CO2, но для высококонцентрированных стимулов может потребоваться перерыв до 24 часов между сериями экспериментов.
Для анализа данных используйте прилагаемую специально разработанную процедуру Matlab для преобразования данных в формат Matlab. Загрузите файл с необработанными данными, созданными программным обеспечением для трекинга в режиме реального времени, и создайте пространственную маску, повторяющую контуры арены. Примените маску к необработанным данным, чтобы удалить все точки данных, выходящие за пределы арены, так как они представляют собой шум.
Затем удалите все точки данных, скорость которых составляет менее 0,163 сантиметров в секунду на протяжении более трех секунд. Эти данные, скорее всего, представляют собой шум или неподвижных мух. Теперь визуализируйте оставшиеся точки данных, построив график для всех них за периоды записи.
Данные также могут быть представлены в виде отдельных траекторий. Границы запахового шлейфа можно быстро оценить на основе поведенческих данных мух. Затем рассчитайте индекс аттракции и проведите статистические тесты, как описано в текстовом протоколе.
В поведенческом аппарате было протестировано 25 самцов и 25 самок мух. В ответ на сухой воздух мухи исследовали всю арену, не проявляя предпочтения к какому-либо квадранту. Линия показывает траекторию перемещения одной мухи.
При подаче яблочного уксуса в воздушный поток верхнего левого квадранта большинство мух были привлечены запахом в этом квадранте. При подаче в верхний левый квадрант репеллентного одоранта (10% этилпропионата) мухи избегали этого квадранта. Индекс привлекательности этого квадранта составил 0,68.
Индекс привлекательности является наиболее широко используемым показателем при измерении обонятельного отклика. Значение выше или ниже нуля указывает на привлечение или отталкивание. Скрипт компенсировал незначительные отклонения в положении арены между сериями экспериментов.
Точки данных, которые могли быть шумом или соответствовать неподвижным мухам, были удалены. Хотя тест можно проводить в течение любого времени, представляется интересным рассматривать изменения в движениях когорты с шагом в 10 секунд, чтобы оценить габитуацию к запаху и другие явления. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое понимание того, как эффективно проводить и анализировать обонятельное поведение в четырехполевом тесте.
После освоения методики каждый ольфакторный эксперимент можно выполнить примерно за час; обычно мы проводим от четырех до шести экспериментов в течение одного дня.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена поведенческая установка и метод анализа данных для оценки обонятельных реакций у плодовых мушек (Drosophila melanogaster). Система предназначена для использования с одним или несколькими обонятельными стимулами и может быть адаптирована для оптогенетического манипулирования подмножествами нейронов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Поведенческая биология
- Обонятельные системы
Теоретические сведения
- Исследование сосредоточено на том, как обонятельные нейронные системы обнаруживают внешние стимулы.
- Понимание того, как мозг декодирует сенсорную информацию, имеет решающее значение для принятия поведенческих решений.
- Установка ольфактометра позволяет проводить контролируемое тестирование обонятельных реакций.
- Данный метод позволяет использовать большую популяцию мух для повторного тестирования.
Цель исследования
- Для анализа обонятельного поведения Drosophila melanogaster.
- Для изучения механизмов обонятельного детектирования и поведенческих реакций.
- Для создания универсальной и надежной экспериментальной базы для будущих исследований.
Используемые методы
- Использование четырехквадрантного ольфактометра для поведенческих анализов.
- Автоматизированное программное обеспечение для трекинга мух с целью сбора данных.
- Подготовка камер с одорантами со специфическими конфигурациями для тестирования.
- Использование контролей с растворителем наряду с тестируемыми одорантами для сравнения.
Основные результаты
- Данная установка позволяет оценивать обонятельные реакции в больших популяциях мух.
- Продемонстрирована универсальность тестирования с использованием различных обонятельных стимулов.
- Надежный сбор данных с помощью автоматизированного трекинга повышает достоверность экспериментов.
- Возможность применения оптогенетических методов для манипулирования нейронной активностью во время анализов.
Выводы
- Данный метод обеспечивает комплексный подход к изучению обонятельного поведения у Drosophila.
- Он открывает возможности для исследования нейронных основ обработки обонятельной информации.
- Данная установка может быть адаптирована под различные экспериментальные задачи в нейробиологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный анализ позволяет проводить высокопроизводительную количественную оценку поведения Drosophila, обусловленного обонянием, что способствует валидации мишеней в нейрофармакологии и сенсорной нейробиологии. Обеспечивая воспроизводимые показатели поведения, связанные с функцией нейронных сетей, этот метод облегчает механистическое снижение рисков при проверке терапевтических гипотез, касающихся обонятельной обработки или хемосенсорных путей. Адаптируемость системы к различным стимулам и генетическим моделям расширяет ее полезность в рабочих процессах раннего поиска для идентификации перспективных соединений и повышения прогностической уверенности в связывании с мишенью.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать обонятельные нейронные цепи для валидации мишеней, участвующих в путях сенсорного обнаружения и поведенческого отклика.
- Практическая ценность: обеспечивает возможность поведенческого скрининга на популяционном уровне с помощью автоматизированного трекинга, что снижает вариабельность и увеличивает пропускную способность при оценке рисков, связанных с мишенями.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные индексы притяжения/отталкивания, которые служат фенотипическими показателями для кампаний по скринингу соединений или генетическому скринингу.
- Практическая ценность: Стандартизированный контроль воздушного потока и конструкция арены обеспечивают воспроизводимость результатов между запусками, что позволяет надежно проводить валидацию анализа для последующего применения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает преемственность от манипуляций с генами или мишенями до измеряемых поведенческих результатов, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров при изучении сенсорных фенотипов.
- Практическая ценность: Совместимость с генетическими моделями (например, трансгенными линиями), что позволяет оценивать влияние нокдауна или гиперэкспрессии мишени на поведение, направляемое обонянием.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего этапа поиска лекарственных средств, связывая генетические или фармакологические воздействия с количественно определяемыми поведенческими результатами, что способствует переходу от идентификации мишени к фенотипической валидации.
- Биологические исследования: позволяет проверять гипотезы о функционировании обонятельных цепей путем измерения поведенческих реакций в режиме реального времени на контролируемые стимулы.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные условия, готовые к проведению анализа, для оценки больших когорт мух при определенных обонятельных воздействиях.
- Аналитика: предоставляет пространственные поведенческие данные и расчеты индекса аттракции, что позволяет проводить количественное сравнение различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связывают нейронные манипуляции с наблюдаемым поведением, подтверждая доклиническую значимость мишеней в путях сенсорной обработки.
- Повторное использование в масштабах предприятия: модульная конструкция ольфактометра позволяет использовать его в нескольких проектах, с различными стимулами и генотипами, что повышает эффективность на уровне платформы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования взаимосвязей между мишенью и поведением за счет снижения уровня шума с помощью автоматизированного трекинга и поведенческой фильтрации.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет строгой валидации воздушного потока, протоколов очистки арены и проверок контрольных экспериментов.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) при валидации мишеней, предоставляя четкие количественные поведенческие фенотипы.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе данных по снижению поведенческих рисков, полученных в ходе ольфакторных тестов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Drosophila, разработки поведенческих тестов и базовые навыки анализа данных в MATLAB или аналогичном ПО.
- Зависит от оборудования для регулирования воздушного потока, систем подачи одорантов и оборудования для видеотрекинга с контролем условий окружающей среды.
- Необходима стандартизация протоколов голодания, очистки арены и проведение контрольных экспериментов для исключения позиционных ошибок или влияния загрязнений.
- Необходимо учитывать специфические для генотипа показатели выживаемости при голодании и соответствующим образом корректировать протоколы для поддержания жизнеспособности когорты.
- Ограничено необходимостью частого промыва системы и риском перекрестного загрязнения высококонцентрированными одорантами, что требует увеличения времени простоя между запусками.
