Обонятельные Поведения, испытываемых Computer Отслеживание Drosophila В четырехквадрантном одориметра

Общая цель этой установки состоит в том, чтобы проанализировать обонятельное поведение мух в четырехквадрантном ольфактометре с использованием предоставленного программного обеспечения для автоматического отслеживания мух. Этот метод может помочь решить ключевые вопросы о том, как обонятельные нейронные системы обнаруживают внешний мир, и как мозг декодирует и направляет поведенческие решения. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она универсальна и надежна, а также позволяет многократно тестировать обонятельные реакции популяции мух на большой экспериментальной арене.

Для этого протокола подготовьте пять камер одоранта, которые состоят из пластикового внешнего контейнера, стеклянного внутреннего контейнера и изготовленной на заказ вставки для крышки из ПТФЭ. Вкладыш представляет собой оригинальную крышку контейнера со снятой центральной частью, а также двумя прикрепленными односторонними клапанами. Используйте четыре камеры одоранта для контроля растворителя и одну камеру для тестового одоранта.

Убедитесь, что каждая камера чистая, а затем загрузите в контейнер с одорантом один миллилитр растворителя или разбавителя одоранта. Затем проверьте положение контейнера в пластиковой камере и убедитесь, что на него не пролилась жидкость. Зафиксируйте крышку с помощью завинчивающейся крышки и уплотнительного кольца на вставке из ПТФЭ, чтобы предотвратить утечки.

Заправляйте мух на стандартной кукурузной муке средней. В стандартную бутылку поместите 30 самцов и 30 самок, и дайте отложить яйца в течение пяти дней при комнатной температуре. Из таких бутылок собирают только что закрытых мух.

Для каждой экспериментальной когорты соберите 25 самцов и 25 самок мух под кратковременной анестезией углекислым газом и дайте группе состариться на стандартной среде для мух в течение двух-четырех дней. За 40-42 часа до эксперимента переложите когорту во флакон с примерно 10 миллилитрами однопроцентного агарозного геля для влажности без приема пищи. Голодание способствует увеличению всего движения, и более 90% мух должны выжить в процессе голодания.

Если умирает более 10%, что может произойти при слабом генотипе, попробуйте использовать однодневное голодание для всех мух в эксперименте. Как минимум за пять минут включите регулятор температуры и установите его на 25 градусов по Цельсию. Затем подключите камеры одоранта к арене с помощью пластиковой трубки.

Проверьте скорость воздушного потока в каждом квадранте арены с помощью электронного расходомера. Убедитесь, что потоки воздуха управления и одоранта работают со скоростью 100 миллилитров в минуту. Мухи очень чувствительны к воздушному потоку, и очень важно, чтобы воздушный поток для каждого квадранта проверялся перед каждым экспериментом.

Теперь очистите арену и стеклянные пластины, используя 70% этанол. Протрите все детали два-три раза и дайте им полностью высохнуть на воздухе, прежде чем продолжить. Далее зажимаем стеклянные пластины к арене.

Затем перенесите мух на арену без анестезии. Используя силу тяжести, дайте им войти через отверстие в одной из стеклянных пластин, а затем закройте отверстие круговой сеткой. Теперь поместите нахлыстовую арену в светонепроницаемую камеру.

Затем подключите четыре управляющих воздушных потока к каждому углу арены. Закройте дверцу камеры и дайте мухам акклиматизироваться к новой среде в течение 10-15 минут. После периода акклиматизации проведите контрольный эксперимент продолжительностью от 5 до 10 минут, в котором мухи подвергаются воздействию четырех контрольных потоков воздуха.

Теперь важно немедленно проанализировать данные. Если мухи распределены по арене неравномерно, арену необходимо сбросить. Крайне важно проверить поведение контрольных мух, чтобы просто очистить воздух.

Это позволит быстро убедиться в том, что все фоновые условия в норме. Утечка света, температурный дисбаланс, наклон арены или загрязнение запахом могут вызвать проблемы. При необходимости выбросьте мух и снова очистите арену.

При подозрении на загрязнение одорантом замените все трубки. Продолжайте повторять контрольный тест с новыми когортами до тех пор, пока животные не проявят предпочтения ни в одном из четырех квадрантов. Затем подсоедините тестовую камеру одоранта к установке с помощью трехходового клапана или снова подсоедините трубку и проведите тестовый эксперимент в течение 5-10 минут.

Для более длительных экспериментальных записей быстро останавливайте и перезапускайте программу слежения каждые 20 минут, иначе файлы данных будут слишком большими. Между тестами выбросьте мухи, очистите арену и стеклянные пластины 70% этанолом и замените соединительные трубки. Поддерживайте поток сухого воздуха, чтобы постоянно продувать систему.

Для эффективности хорошо иметь две арены, чтобы во время пробежек можно было проводить уборку. Если в один и тот же день несколько экспериментов оказались неверными, будьте предельно осторожны, чтобы в системе не осталось запаха от предыдущего прогона. Обычно это не является проблемой при низких концентрациях одоранта или CO2, но для высококонцентрированных стимулов может потребоваться интервал до 24 часов между прогонами эксперимента.

Для анализа данных используйте специально разработанную процедуру Matlab для преобразования данных в формат Matlab. Загрузите файл необработанных данных, созданный в режиме реального времени программным обеспечением для слежения, и создайте пространственную маску, которая повторяет контуры арены. Примените маску к необработанным данным, чтобы удалить все точки данных, которые находятся за пределами арены, так как они представляют собой шум.

Затем удалите все точки данных, которые движутся со скоростью менее 0,163 сантиметра в секунду в течение более трех секунд. Эти данные, скорее всего, являются шумом или неподвижными мухами. Теперь визуализируйте оставшиеся точки данных, нанеся их на график по периодам записи.

Данные также можно рассматривать в виде отдельных траекторий. Границы запаха могут быть быстро оценены на основе поведенческих данных мухи. Затем рассчитайте индекс привлекательности и проведите статистические тесты, как описано в текстовом протоколе.

В поведенческом аппарате было протестировано 25 самцов и 25 самок мух. В ответ на сухой воздух мухи исследовали всю арену, не отдавая предпочтения какому-либо квадранту. Линия показывает отслеживаемую траекторию движения одной мухи.

Когда яблочный уксус был введен в верхний левый квадрант воздушного потока, большинство мух были привлечены этим квадрантом запаха. Когда репеллентный одорант, 10% этилпропионат, был введен в верхний левый квадрант, этого квадранта удалось избежать. Привлекательный индекс этого квадранта набрал 0,68.

Привлекательный индекс является наиболее широко используемым индексом для измерения обонятельной реакции. Значение выше или ниже нуля указывает на притяжение или отталкивание. Сценарий компенсировал небольшие изменения в положении арены между испытаниями.

Точки данных, которые могли быть шумом или неподвижными мухами, были удалены. Несмотря на то, что тест можно проводить в течение любой продолжительности, интересно наблюдать за изменениями в движениях когорты в течение 10-секундных интервалов, чтобы оценить привыкание к запахам и другие явления. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как эффективно запускать и анализировать обонятельное поведение в четырехпольном анализе.

После освоения каждый обонятельный эксперимент может быть завершен примерно за час, и мы обычно проводим от четырех до шести экспериментов в течение одного дня.