Протокол Выделяя мыши Круг Уиллис

Общая цель этой процедуры препарирования состоит в том, чтобы изолировать мышиный круг Виллиса, чтобы облегчить изучение крупных сосудов цереброваскулятора мыши. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении экспрессии цереброваскулярных генов при различных заболеваниях, влияющих на церебральные сосуды, таких как болезнь Альцгеймера и церебральная амелоидная ангиопатия. Основное преимущество этой методики заключается в том, что крупные сосуды можно быстро и легко изолировать без изменения структуры сосуда.

Начните с использования ножниц для радужной оболочки глаза, чтобы сделать четырехсантиметровый разрез на брюшной стенке и брюшине мыши со смертельным обезболиванием прямо под грудной клеткой. Далее сделайте разрез длиной в несколько миллиметров в области диафрагмы, продолжая разрез по всей длине грудной клетки, чтобы обнажить плевральную полость. Поднимите грудину и зажмите кончик гемостатом, упирая кровоостанавливатель в шею.

Затем тщательно обрежьте жировую ткань, соединяющую грудину с сердцем. Теперь проведите иглу 15-го калибра через левый желудочек в верхушку сердца и с помощью ножниц разрежьте одну из долей печени, чтобы создать выход для перфузата. Перфузируйте животное от 25 до 50 миллилитров PBS со скоростью насоса 2,5 миллилитра в минуту в течение примерно десяти минут.

Печень должна побледнеть, так как кровь заменяется на PBS. Когда жидкость из печени станет полностью прозрачной, прекратите перфузию. Чтобы изолировать мозг, с помощью ножниц радужной оболочки глаза сделайте разрез по средней линии кожи от шеи до носа.

Обрежьте кожу ножницами для радужной оболочки глаза, чтобы обнажить череп и удалить остатки мышц и жировой ткани. Затем поместите кончики ножниц Iris в одну сторону большого затылочного отверстия и осторожно сдвиньте кончики вдоль внутренней поверхности черепа к наружному слуховому проходу. Сделайте аналогичный разрез с другой стороны большого затылочного отверстия с последующим разрезом по средней линии по внутренней поверхности межтеменной кости до начала сагиттального шва.

Вставьте закрытые ножницы радужной оболочки в лобную кость между глазами в сагиттальном шве и раскройте лезвия, чтобы расколоть череп надвое. С помощью щипцов возьмитесь за обонятельные луковицы и с помощью ножниц Iris перережьте нервные связи на вентральной поверхности мозга. Затем погрузите мозг в 60-миллиметровую чашку Петри с ледяным PBS.

Чтобы выделить круг Виллиса, перенесите чашку на пакет со льдом под препарирующим микроскопом и поверните мозг на его дорсальную поверхность, чтобы визуализировать круг Виллиса. С помощью небольших щипцов захватите передние мозговые артерии у основания обонятельных долей и надавите, чтобы отделить артерии от сосудистого континуума. Таким же образом перережьте средние мозговые артерии.

Затем острыми концами щипцов захватите средние мозговые артерии и приподнимите начало задних сообщающихся артерий, отсоединив оба набора артерий от мозга. Далее поднимите передние артерии, осторожно потянув их за зрительный нерв в переднем дорсальном направлении. Таким же образом удаляют верхнюю и заднюю артерии мозжечка с последующим смещением базилярной артерии.

Наконец, с помощью щипцов аккуратно переместите весь круг Виллиса в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую ледяной PBS, и зафиксируйте сосуды на месте маленькими булавками, используя два щипца, чтобы аккуратно удалить остатки мозговой ткани. Виллизис круг должен выходить цельным, и должен быть слегка прозрачным благодаря отсутствию остаточной крови в сосудистой сети. Чистый круг Виллиса должен специфически экспрессировать маркеры гладких мышечных клеток сосудов, такие как актин гладкой мускулатуры, тяжелая цепь гладкой мускулатуры миозина и гладелин.

Нейронные маркеры, такие как гликопротеин миелина олигодендроцитов или ассоциированный белок 2, связанный с микротрубочками, напротив, должны быть едва заметны в круге Виллиса. Кроме того, экспрессия эндотелиального маркера, Е-Селектина, в некольце нейронной ткани Виллиса очень похожа на экспрессию, полученную для кругов образцов Виллиса, что, возможно, отражает существование мозговой капиллярной сети. После освоения этой техники ее можно выполнить за два часа, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что сосуды головного мозга мыши очень тонкие и легко ломаются. Таким образом, вскрытие следует проводить очень аккуратно, без спешки, чтобы вся конструкция была собрана целиком. После своего развития этот метод открывает путь исследователям в области воспалительных нервных заболеваний к изучению сосудистых расстройств головного мозга в мышиной модели болезни Альцгеймера и связанных с ней заболеваний, таких как церебральная амилоидная ангиопатия.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать круг виллиса от мыши.