Разработка Вставка совместного культивирования системы двух клеточных типов в отсутствие межклеточных контактов

Общая цель данной процедуры — создать систему клеточного кокультивирования двух типов клеток с использованием вкладок с проницаемой мембраной, что обеспечит диффузию секретируемых растворимых факторов. Это достигается за счет ряда этапов, в ходе которых в многолуночный планшет для культивирования тканей, содержащий второй тип клеток, аккуратно помещают вставки с первым типом клеток. Мы начинаем с посева первого типа клеток во вставки и посева второго типа клеток в многолуночный планшет для культивирования тканей.

Вторым этапом является перенос вставок в лунки планшета, содержащего тип клеток номер два. В конечном итоге это позволяет собрать оба типа клеток, а также соответствующие супернатанты. Таким образом, становится возможным оценить влияние секретируемых растворимых факторов на исследуемый тип клеток.

В многоклеточных организмах секретируемые растворимые факторы вызывают ответы различных типов клеток в результате паракринной сигнализации. Таким образом, ценность системы совместного культивирования с использованием вставок (инсертов) заключается в возможности оригинального способа оценки изменений клеточных параметров, опосредованных секретируемыми растворимыми факторами, при отсутствии межклеточного контакта. Системы совместного культивирования с инсертами обладают рядом преимуществ по сравнению с другими методами совместного культивирования, таких как: во-первых, однонаправленная сигнализация; во-вторых, сохранение полярности клеток; и в-третьих, возможность специфического для каждой популяции детектирования клеточных изменений.

Ниже будет подробно описан специфический протокол измерения токсического воздействия цитокинов, секретируемых микроглией N9, активированной липополисахаридами, на нейрональные клетки PC12, что позволит детально изучить методику совместного культивирования в inserts. Для начала извлеките из упаковки 24-луночный планшет для культивирования тканей и вкладыши-инсерты из политетрафторэтилена с порами 0,4 мкм. Затем поместите вкладыши в пустые лунки планшета, удерживая их за верхний край с помощью стерильного пинцета.

Затем заполните вставки стандартной средой N9 так, чтобы мембрана была полностью покрыта. Инкубируйте вставки в течение как минимум одного часа или в течение ночи, чтобы улучшить адгезию клеток. Когда вставки будут готовы, проведите пассирование микроглии в среде N9 при достижении 80–90% конфлюэнтности, чтобы получить клеточную суспензию для посева во вставки.

Затем удалите стандартную среду из вставок, стараясь не проколоть мембрану наконечником микропипетки. Далее засейте каждую вставку суспензией клеток в объеме 50 мкл из расчета 60 000 клеток на квадратный сантиметр или в соответствии с протоколом производителя вставок. При распределении клеточной суспензии периодически переворачивайте пробирку, чтобы поддерживать ее гомогенность.

После посева всех вставок осторожно покачайте планшет вперед-назад, затем слева направо, чтобы равномерно распределить клетки. Избегайте круговых движений, так как это приведет к скоплению клеток в центре вставки. Затем инкубируйте планшет со вставками в течение 24 часов, прежде чем приступать к активации микроглии N9.

Начните с того, что отвесьте 10 мг липополисахарида и поместите его в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл для последующего использования. Поскольку липополисахарид является мощным провоспалительным эндотоксином и требует особых мер предосторожности, настоятельно рекомендуется использовать защитные очки, перчатки и респиратор для защиты от твердых частиц. После этого приготовьте серию последовательных разведений липополисахарида, используя теплую среду для культивирования клеток N9, чтобы получить рабочие растворы с концентрацией 4, 2 и 1 мкг/мл.

Наконец, удалите половину культуральной среды из инсертов, стараясь не потревожить клетки. Затем осторожно добавьте в инсерты 25 microliters рабочих растворов липополисахарида, чтобы получить конечные разведения 2, 1 или 0.5 micrograms per milliliter. Инкубируйте планшет еще в течение 24 часов перед началом экспериментов по совместному культивированию.

Для этого этапа требуются клетки PC12, высеянные с плотностью 30 000 клеток на квадратный сантиметр и дифференцированные в интернейроны, а также микроглия N9, активированная липополисахаридом в течение 24 часов, как описано в предыдущем разделе. Начните с осторожного удаления всей среды из инсертов и её замены 50 µL свежей теплой среды для обработки N9. Это необходимо для удаления всех следов липополисахарида, чтобы в системе осталась только активированная микроглия N9.

Имейте в виду, что вставки неплотно прилегают к лункам планшета для культивирования тканей и могут сместиться, если слишком сильно надавить наконечником на стенку. Этот этап следует выполнять поочередно для каждой вставки, чтобы предотвратить высыхание клеток из-за длительного контакта с воздухом. Затем полностью удалите среду нейрональных клеток PC12 и замените ее 0,6 milliliters свежей теплой среды для обработки PC12.

Выполняйте эту процедуру поочередно для каждой лунки, чтобы предотвратить высыхание клеток. С помощью пинцета захватите верхний край вставки и осторожно поместите ее в лунку с нейрональными клетками PC12. После переноса всех вставок проверьте наличие пузырьков воздуха под мембранами вставок.

Пузырьки воздуха препятствуют обмену веществ через мембрану вставки и могут поставить под угрозу весь эксперимент. Удалите все пузырьки воздуха, очень осторожно приподняв вставку из лунки с помощью пинцета и снова поместив ее в среду для культивирования клеток; это действие должно устранить большинство пузырьков. Если же пузырьки остаются, попробуйте осторожно погрузить вставку обратно в среду для культивирования клеток под углом.

Не стучите по вставкам и не перемешивайте их содержимое, так как это может привести к диссоциации адгезивных клеток. После этого проверьте объемы среды как во вставках, так и в лунках; уровень жидкости в обоих отсеках должен быть примерно одинаковым. Когда все пузырьки воздуха будут удалены, а объемы среды станут соответствующими, поместите планшет в инкубатор.

Затем можно собрать клетки, культуральную среду или и то, и другое для измерения эффектов паракринной сигнализации между микроглией N9 и нейрональными клетками PC12. Для количественного определения провоспалительных цитокинов в культуральной среде нижнего компартмента проводили иммуноферментный анализ. Результаты показывают, что через 24 часа после периода активации микроглия N9, обработанная липополисахаридом в концентрации 2 µg/mL, секретировала значительно больше провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-6, фактор некроза опухоли-альфа и интерферон-гамма, по сравнению с необработанной микроглией.

Кроме того, микроглия N9, обработанная липополисахаридом в концентрации 1 µg/mL, секретировала заметно больше интерферона гамма через 24 часа, в то время как для значительного повышения уровней интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли-альфа в культуральной среде потребовалось 48 часов. Напротив, при использовании концентрации 0,5 µg/mL экспрессия цитокинов в микроглии N9 не усиливалась ни через 24, ни через 48 часов после периода активации. Более того, данные через 24 часа в группе с концентрацией 2 µg/mL свидетельствуют о наличии микроглиоза — увеличении популяции микроглии.

Однако значительное увеличение количества клеток наблюдалось только через 48 часов. Наконец, чтобы оценить последствия активации микроглии, приводящие к усилению секреции цитокинов и микроглиозу, была исследована цитотоксичность в кокультуре нейрональных клеток PC12. Измерение уровней внеклеточной лактатдегидрогеназы, высвобождаемой поврежденными клетками, показало, что в нейрональных клетках PC12 наблюдалось большее количество гибели клеток по мере увеличения концентрации липополисахарида на клетках N9.

Таким образом, данные результаты показывают, что секретируемые растворимые факторы способны проникать через мембрану вставок для совместного культивирования и могут вызывать цитотоксическое повреждение нейрональных клеток PC12 при отсутствии межклеточного контакта. Хотя здесь был представлен только один вариант совместного культивирования с использованием вставок, данный метод является очень гибким. В настоящем протоколе один тип клеток подвергался предварительной обработке молекулой, ответственной за снижение секреции растворимых факторов, которые после переноса вставки в лунку влияют на поведение второго типа клеток.

Однако можно инкубировать оба типа клеток вместе в системе совместного культивирования, чтобы выявить повышенную чувствительность или резистентность одной или обеих популяций клеток к последующему воздействию. Этот метод может быть использован в упрощенном варианте — путем совместной инкубации двух популяций клеток без какого-либо воздействия, например, для оценки базовой взаимной паракринной сигнализации. Помимо применения в области нейровоспаления, как показано здесь, системы совместного культивирования могут быть использованы для решения широкого круга вопросов, касающихся регенерации опухолей, нейролатриризма, сигналов апоптоза или любой другой темы, включающей компонент паракринной сигнализации.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как системы совместного культивирования с использованием вставок-инсертов могут стать простым способом оценки изменений, опосредованных секретируемыми растворимыми факторами. Мы надеемся, что смогли убедить вас в высоком потенциале таких систем совместного культивирования для изучения многоклеточной паракринной сигнализации в отсутствие межклеточных контактов.