Разработка Вставка совместного культивирования системы двух клеточных типов в отсутствие межклеточных контактов

Общая цель этой процедуры заключается в создании клеточной системы совместного культивирования двух типов клеток с использованием вставок с проницаемой мембраной, что позволяет диффузировать секретируемые растворимые факторы. Это достигается с помощью ряда этапов, в ходе которых вставки, содержащие один тип клеток, точно помещаются в многолуночную культуральную пластину для тканей, содержащую второй тип клеток. Мы начинаем засевающую ячейку типа один во вкладышах и засевающую ячейку типа два в многолуночный планшет для культивирования тканей.

Вторым этапом является перенос вставок в лунки пластины, содержащей ячейку типа два. В конечном счете, это дает возможность собирать два типа клеток, а также соответствующие надосадочные потоки. Таким образом, можно оценить влияние секретируемых растворимых факторов на интересующий тип клеток.

В многоклеточных организмах секретируемые растворимые факторы вызывают реакцию у различных типов клеток в результате паракринной сигнализации. Таким образом, ценность системы совместного культивирования вкладышей заключается в ее способности предложить оригинальный способ оценки изменений клеточных параметров, опосредованных секретируемыми растворимыми факторами в отсутствие межклеточного контакта. Вставные системы ко-культуры имеют различные преимущества по сравнению с другими методами ко-культуры, такими как: один с помощью направленной сигнализации; полярность двух консервативных клеток; и три популяционно-специфичных обнаружения клеточных изменений.

Конкретный протокол измерения токсических эффектов цитокинов, секретируемых микроглией N9, активированной липополисахаридом, на нейрональные клетки PC12 будет подробно описан ниже, что обеспечит конкретное понимание методологии совместного культивирования вставок. Для начала разверните 24-луночный планшет для культуры тканей и вкладыши с содержанием политетрафторэтилена размером 0,4 микрона из упаковки. Затем поместите вкладыши в пустые лунки планшета для культивирования тканей, взявшись за самый верхний край вкладыша с помощью стерильного пинцета.

Далее заполните вкладыши обычным средством N9 до полного покрытия мембраны. Инкубируйте вкладыши не менее одного часа или в течение ночи, чтобы улучшить способность клеток к прикреплению. Как только вставки будут готовы, разделите микроглию N9 при конфлюенции от 80 до 90% с помощью обычной среды N9, чтобы получить клеточную суспензию, которая будет использоваться для засеивания вставок.

Затем удалите обычную среду из вкладышей, стараясь не проколоть мембрану наконечником микропипетки. Затем засейте каждую вставку из расчета 60 000 клеток на квадратный сантиметр 50 микролитрами клеточной суспензии или в соответствии с протоколом производителя вставки. Распределяя клеточную суспензию, следите за тем, чтобы она оставалась однородной, периодически переворачивая трубку.

Когда все вставки будут засеяны, аккуратно покачивайте пластину вперед и назад, затем слева направо, чтобы равномерно распределить ячейки. Избегайте круговых движений, так как это приведет к скоплению ячеек в центре вставки. Затем инкубируйте планшет, содержащий вкладыши, в течение 24 часов перед активацией микроглии N9.

Начните с взвешивания 10 миллиграммов липополисахарида и храните его в 1,5-миллилитровой пробирке Eppendorf Tube для последующего использования. Поскольку липополисахарид является мощным провоспалительным эндотоксином и требует особых мер предосторожности, настоятельно рекомендуется использовать очки, перчатки и респиратор для защиты от твердых частиц. После этого создают набор серийных разведений липополисахарида с использованием теплой обрабатывающей среды N9 для получения рабочих растворов в четыре, два и один микрограмм на миллилитр.

Наконец, удалите половину питательной среды из вкладышей, стараясь не потревожить клетки. Затем аккуратно добавьте 25 микролитров рабочих растворов липополисахарида во вставки, чтобы получить окончательные разведения два, один или 0,5 микрограмма на миллилитр. Инкубируйте планшет еще 24 часа, прежде чем приступать к экспериментам по совместному выращиванию.

На этом этапе клетки PC12 были покрыты дифференцированными интернейронами с концентрацией 30 000 клеток на квадратный сантиметр, а микроглия N9 активировалась липополисахаридом в течение 24 часов, как описано в предыдущем разделе. Начните с осторожного удаления всей среды со вставок и замените ее 50 микролитрами свежей, теплой среды для обработки N9. Это необходимо для того, чтобы удалить все следы липополисахарида, оставив только активированную микроглию N9.

Имейте в виду, что вставки ослаблены в лунках планшета для культивирования тканей и могут смещаться, если наконечник слишком сильно прижат к стене. Этот шаг следует выполнять по одной вставке за раз, чтобы предотвратить высыхание клеток из-за длительного контакта с воздухом. Затем полностью удалите нейрональную клеточную среду PC12 и замените ее 0,6 миллилитрами свежей, теплой среды для обработки PC12.

Делайте это хорошо по одной, чтобы убедиться, что клетки не пересыхают. С помощью пинцета возьмитесь за самый верхний край вставки и аккуратно поместите ее в лунку, содержащую нейронные клетки PC12. Когда все вкладыши будут перенесены, проверьте наличие пузырьков воздуха под мембранами вкладышей.

Пузырьки воздуха препятствуют любому обмену через мембрану вкладыша и могут поставить под угрозу весь эксперимент. Удалите любые пузырьки воздуха, очень аккуратно приподняв вставку из лунки с помощью пинцета и поместив ее обратно в среду для клеточной культуры, это действие должно избавить от большинства пузырьков. Тем не менее, для стойких пузырьков попробуйте осторожно опустить вставку обратно в среду для клеточной культуры под углом.

Не стучите и не перемешивайте вставки, так как это имеет тенденцию вызывать диссоциацию адгезивных клеток. После этого проверьте объемы среды как во вкладышах, так и в лунках, жидкость в обоих отсеках должна быть примерно на одном уровне. Когда все пузырьки воздуха будут удалены, а объемы среды будут соответствующими, инкубируйте планшет.

Клетки, питательная среда или и то, и другое могут быть затем собраны для измерения эффектов паракринной передачи сигналов между микроглией N9 и нейрональными клетками PC12. Иммуноферментные анализы проводили на клеточной культуральной среде нижнего компартмента для количественного определения провоспалительных цитокинов. Результаты показывают, что через 24 часа после периода активации микроглия N9, обработанная двумя микрограммами на миллилитр липополисахарида, секретировала значительно больше провоспалительных цитокинов, таких как интерлукен-6, фактор некроза опухоли-альфа и интерферон гамма, по сравнению с микроглией, которые не лечились.

Кроме того, микроглия N9, обработанная одним микрограммом на миллилитр липополисахарида, секретировала значительно больше интерферона гамма через 24 часа, в то время как потребовалось 48 часов, чтобы увидеть значительное увеличение уровней интерлукена-6 и фактора некроза опухоли-альфа в клеточной среде. Напротив, концентрация 0,5 мкг на миллилитр не способствовала увеличению экспрессии цитокинов в микроглии N9 как через 24, так и через 48 часов после периода активации. Более того, данные за 24 часа в группе с двумя микрограммами на миллилитр позволяют предположить, что имел место микроглиоз, увеличение популяции микроглии.

Однако только через 48 часов сотовый номер был значительно увеличен. Наконец, для оценки последствий активации микроглии, приводящей к усилению секреции цитокинов и микроглиозов, оценивали цитотоксичность в ко-культивируемых нейрональных клетках PC12. При измерении уровней внеклеточной лактатдегидрогеназы, которая выделяется поврежденными клетками, было обнаружено, что нейрональные клетки PC12 демонстрируют большую гибель клеток по мере увеличения концентрации липополисахарида в клетках N9.

Таким образом, эти результаты показывают, что секретируемые растворимые факторы способны проникать через мембрану ко-культурных вставок и могут вызывать цитотоксическое повреждение нейрональных клеток PC12 в отсутствие межклеточного контакта. Несмотря на то, что здесь был представлен только один сценарий вставки сокультуры, это очень гибкий метод. В этом протоколе один тип клеток предварительно обрабатывали молекулой, отвечающей за снижение секреции растворимых факторов, которые при переносе вкладыша в лунку влияют на поведение второго типа клеток.

Тем не менее, можно инкубировать оба типа клеток вместе в системе совместного культивирования для выявления повышенной слабости или устойчивости одной или обеих клеточных популяций к последующему лечению. Этот метод может просто использовать две популяции клеток, инкубированных вместе без какого-либо лечения, например, для оценки базальной паракринной реципрокной сигнализации. В дополнение к тому, что они ценятся в области нейровоспаления, как показано здесь, системы совместного культивирования вкладышей могут быть использованы для ответа на широкий круг вопросов, относящихся к регенезу опухоли, нейролатирисме, передаче сигналов апоптоза или любой другой теме, содержащей компонент паракринной сигнализации.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как системы совместной культуры могут предложить простой способ оценки изменений, опосредованных секретируемым растворимым фактором. И мы надеемся, что убедили вас в высоком потенциале этих систем совместной культуры в изучении многоклеточной паракринной сигнализации в отсутствие межклеточного контакта.