Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) и экспрессии генов Анализ Fos-экспрессирующих Нейроны из свежих и замороженных крыс ткани головного мозга

Общая цель этой процедуры заключается в диссоциации Fos-экспрессирующих нейронов из свежей или замороженной мозговой ткани взрослой крысы для последующей флуоресцентной сортировки активированных клеток, или FACS. Этот метод может быть использован для выделения нейрональных клеток, представляющих интерес для идентификации уникальной молекулярной нейроадаптации поведенческих активированных нейронов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет использовать замороженную ткань, облегчая выделение клеток из нескольких областей мозга в разные дни.

Чтобы обработать эту свежую мозговую ткань, вставьте два или более предварительно охлажденных бритвенных лезвия в пазы ледяной матрицы для среза мозга, чтобы разрезать один-два миллиметровых корональных среза, содержащих интересующие области мозга, помещая эти срезы на охлажденную стеклянную пластину по мере их разрезания. Сначала препарируйте интересующую область мозга, отбросьте другие области и удалите белое вещество. Чтобы заморозить ткань, перенесите образцы в микропробирку и погрузите пробирку в изопентан при температуре минус 40 градусов Цельсия на 20 секунд для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшей обработки.

Чтобы измельчить ткань, дайте образцам оттаять на холодной стеклянной пластине не более чем на одну минуту, прежде чем покрыть образцы одной-двумя каплями раствора буфера А. Далее, держа лезвие бритвы полностью вертикально к пластине, измельчите ткань по 100 раз в каждом ортогональном направлении. Чтобы тщательно измельчить ткань, крайне важно поддерживать ткань влажной с помощью буфера А и следовать указанному времени и указанию измельчения.

Крайне важно удалить большую часть белого вещества во время рассечения тканей и сохранить ткань, покрытую буфером А, чтобы повысить эффективность измельчения и сохранить здоровье клеток. Когда ткань будет тщательно обработана, используйте лезвие бритвы, чтобы перенести кусочки в микроцентрифужную трубку, содержащую один миллилитр холодного буфера А, и переверните трубку от трех до пяти раз, чтобы погрузить всю измельченную ткань в раствор. Чтобы диссоциировать фрагменты ткани на одноклеточную суспензию, гранулируйте образцы методом центрифугирования.

Выбросьте надосадочную жидкость. Затем медленно добавьте один миллилитр холодного, только что размороженного ферментного раствора по внутренней стенке микротрубки. И используйте пипетку большого диаметра кончика, чтобы немедленно аспирировать и дозировать всю каждую гранулу четыре раза, чтобы рассеять кусочки измельченной ткани.

Затем быстро переверните микропробирку, чтобы гранулы не прилипли к дну пробирки, и инкубируйте образец с перемешиванием из конца в конец в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. По окончании разложения снова центрифугируйте пробирку, и добавьте в клетки 0,6 миллилитра холодного буфера А. Используя тот же наконечник пипетки, немедленно отасуньте и дозируйте гранулы пять раз.

Затем выберите стеклянную пипетку диаметром 1,3 мм и с ее помощью аккуратно растирайте образцы 10 раз. Поместите образец на лед на две минуты, чтобы мусор и недиссоциированные клетки осядли на дно пробирки. Затем переложите надосадочную жидкость в новую 15-миллилитровую трубку.

Затем добавьте 600 микролитров раствора буфера А к оставшейся грануле и с помощью пипетки диаметром 0,8 миллиметра растерите образец еще 10 раз. После того, как ткани осядут, как показано выше, объедините надосадочную жидкость с первой клеточной суспензией и добавьте еще 600 микролитров буфера в гранулу. Затем с помощью пипетки диаметром 0,4 мм разрастите образец и поместите пробирку на лед на две минуты, чтобы ткани осели.

Следование этапам механической растирания в протоколе важно для успешной сортировки. После этого объедините надосадочную жидкость с диссоциированными клетками. Затем добавьте в образец 600 микролитров буфера А и повторите растирание пипеткой 0,4 миллиметра еще три раза.

Поместите трубки на лед на две минуты, чтобы клетки остыли. А затем скапливаем надосадочную жидкость во второй 15-миллилитровой пробирке. Повторите процесс растирания еще три раза, используя самую маленькую стеклянную пипетку, значительно увеличивается выход клеток для последующей сортировки.

После того, как все надосадочные жидкости будут собраны, добавьте 800 микролитров отрицательного 20 градусов Цельсия 100% этанола в четыре миротрубки на льду. Затем перенесите 800 микролитров клеток из первой пробирки собранной надосадочной жидкости в каждую из первых двух пробирок этанола и по 800 микролитров клеток из второй пробирки надосадочной жидкости в каждую из двух последних пробирок с этанолом. Переверните пробирки, чтобы перемешать образцы.

Затем поместите образцы на лед на 15 минут, перемешивая путем инверсии каждые пять минут. По окончании инкубации центрифугируйте клетки. Затем, касаясь только стенки микротрубки, с помощью микропипетки медленно удалите все, кроме последних 50 микролитров каждой надосадочной жидкости.

Отфильтруйте каждую из двух клеточных суспензий по отдельности с помощью двух разных пар клеточных фильтров. Затем клетки готовы к мечению антителами против представляющих интерес клеточных маркеров и сортировке с помощью проточной цитометрии. Анализ свежих и замороженных образцов тканей мозга выявляет наличие небольших однородных популяций нейрональных клеток со схожим размером и зернистостью.

Небольшие однородные популяции могут быть закрыты для исключения любых клеточных агрегатов, а нейроны могут быть идентифицированы по их положительному NeuN и DAPI. Как в свежих, так и в замороженных образцах тканей уровни мРНК NeuN также значительно выше в NeuN-положительных популяциях, чем в NeuN-отрицательных. Напротив, уровни мРНК маркеров глиальных и олидогодендроцитарных клеток выше в NeuN-отрицательной популяции, чем в NeuN-положительной популяции.

Аналогичная тенденция к повышению уровня мРНК микрогиальных клеточных маркеров наблюдается в NeuN-отрицательной популяции, хотя это не было статистически значимым. Кроме того, уровни мРНК Fos выше в Fos-положительных нейронах, чем в Fos-отрицательных, при этом в три раза увеличивается мРНК Fos в Fos-положительных нейронах из свежей ткани и в одиннадцать раз увеличивается мРНК Fos в Fos-положительных нейронах из замороженной ткани, что подтверждает валидность метода для идентификации специфических генов, представляющих интерес, из отсортированных по потоку клеток как в свежих, так и в замороженных тканях. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о соблюдении критических шагов по предотвращению лизиса клеток.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как флуоресцентная активированная сортировка клеток, для выделения представляющих интерес подмножеств клеток для дальнейшего молекулярного анализа. Использование замороженной ткани позволяет сортировать образцы в отдельные дни, что имеет решающее значение для экспериментов, связанных с длительными и сложными процедурами забора и подготовки тканей. Этот метод также может быть использован для подготовки посмертно замороженных образцов человеческого мозга, хранящихся в течение нескольких месяцев или лет, для сортировки методом проточной цитометрии.

Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе поведения нейронов, экспрессирующих Fos, или других иммунометированных клеток дикого типа, представляющих интерес. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как диссоциировать клетки из свежей или замороженной ткани мозга крысы для флуоресцентной активированной сортировки нейронов или типов клеток, представляющих интерес.