Добыча и анализ микробных фосфолипидов жирных кислот в почвах

Общей целью данного лабораторного протокола является получение информации о структуре почвенных микробных сообществ путем идентификации фосфолипидных жирных кислот. Этот метод может помочь ответить на ключевые научные вопросы, такие как характеристика реакции почвенных микроорганизмов на изменения в управлении земельными ресурсами или на природные нарушения. Основное преимущество этого метода заключается в том, что это простой в использовании, надежный протокол, который можно применять к широкому спектру типов почв.

Итак, этот протокол будет демонстрировать Кейтлин Претцлафф, техник нашей исследовательской школы. Чтобы начать экстракцию, приготовьте 5,0 молярного гидроксида калия и 0,15 молярного цитратного буфера, как описано в текстовом протоколе. Ежедневно готовьте суррогат нонеконоата стандартного соотношения 19:0, разводя 250 микролитров исходного раствора в 25 миллилитрах хлороформа.

Это обеспечивает достаточный суррогатный стандарт для партии из 23 образцов. Добавьте 0,5 миллилитра суррогатного стандартного раствора 19:0 в пробирку для образца центрифуги. Чтобы провести экстракцию по методу Блая и Дайера на образце почвы, добавьте 2,0 миллилитров цитратного буфера, затем 2,5 миллилитров хлороформа, а затем 5,0 миллилитров метанола.

Накройте образец колпачком с покрытием из ПТФЭ и заверните его на 30 секунд. Затем поместите его в шейкер на два часа. Через два часа центрифугируйте образец при температуре 226 раз G в течение 15 минут с крышкой.

Удалите надосадочную жидкость с помощью пастеровской пипетки и переложите ее в стеклянный флакон объемом 45 миллилитров с этикеткой. Добавьте второй раунд экстрагента Bligh and Dyer к каждому образцу и повторите этапы встряхивания и центрифугирования. Отожмите надосадочную жидкость с помощью пастеровской пипетки и перенесите ее в тот же стеклянный флакон объемом 45 миллилитров.

Далее добавьте 5,0 миллилитров хлороформа и 5,0 миллилитров цитратного буфера в маркированный стеклянный флакон объемом 45 миллилитров, содержащий надосадочную жидкость. Закройте его белым колпачком с облицовкой из ПТФЭ и переведите стеклянный флакон на 30 секунд. Осторожно пропылесосьте верхнюю водную фазу 45-миллилитрового флакона.

Дозируйте нижнюю органическую фазу в промаркированный флакон объемом 15 миллилитров. Поместите партию 15-миллилитровых флаконов под сжатый азот комнатной температуры, чтобы избежать окисления. Медленно испаряйте хлороформ, устанавливая поток азота так, чтобы он взъерошил поверхность жидкости во флаконе, но не поднимался по стенкам флакона.

Накрутите крышку с облицовкой из ПТФЭ и храните образцы в морозильной камере при температуре минус 20 градусов Цельсия, завернутые в алюминиевую фольгу. При необходимости маркируйте новые колонки для твердофазной экстракции или SPE. Поместите держатель колонны SPE с патрубками на стеклянный бак и вставьте в него колонки с маркировкой.

Кондиционируйте каждую колонку, добавив 5 миллилитров ацетона и дав ему стечь. Затем добавьте две добавки по 5 миллилитров хлороформа. Дайте второму хлороформу вытечь, пока он не поднимется примерно на 1 миллилитр выше, а затем закройте кран.

Повторно растворите образец, добавив в флакон 0,5 миллилитра хлороформа и осторожно перемешайте. Перенесите повторно растворенный образец в колонку SPE с помощью пипетки Pastuer. Положите образец липидов непосредственно на центр колонки и дайте растворителю полностью стечь в резервуар.

Выбавьте нейтральные липиды, добавив по 5 миллилитров хлороформа в каждую колонку. Дайте растворителю полностью стечь в бак. Разбавьте гликолипиды, добавив 5 миллилитров ацетона в каждую колонку, что позволит растворителю полностью стечь в резервуар для сбора.

Снимите подставку для колонны с бака и слейте воду из бака с помощью вакуумного аппарата. Вставьте штатив с чистыми и промаркированными центрифужными пробирками в бак и установите на бак подставку для колонны. Столбец с маркировкой выше должен совпадать с пробиркой центрифуги с маркировкой ниже.

Выведите фосфолипиды в центрифужные пробирки, добавив по 5 миллилитров метанола в каждую колонку. Подождите, пока колонны SPE высохнут в вытяжном шкафу, прежде чем утилизировать их. Фосфолипидные фракции высушить при комнатной температуре в условиях сжатого азота.

После продувки пробирок азотом закрутите крышки с облицовкой из ПТФЭ и храните образцы в морозильной камере при температуре минус 20 градусов Цельсия, завернутые в алюминиевую фольгу. Включите водяную баню, выставленную на 37 градусов Цельсия. Достаньте образцы из морозильной камеры и дайте образцам нагреться до комнатной температуры.

Добавьте 0,5 миллилитров хлороформа и 0,5 миллилитров метанола в каждый образец, а затем 1,0 миллилитра матанолового гидроксида калия. Плотно закройте пробирки крышками с покрытием из ПТФЭ и перемешайте. Поместите запечатанные образцы в ванну при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут.

Убедитесь, что уровень воды находится как минимум на один-два миллиметра выше уровня жидкости для пробы. Пока образцы находятся на водяной бане, пометьте небольшие стеклянные флаконы идентификаторами образцов. Через 30 минут извлеките образцы и дайте им остыть.

Далее добавьте по 2,0 миллилитров гексана в каждый образец и перемешайте. Затем добавьте 0,2 миллилитра 1,0 молярной уксусной кислоты в каждый образец и снова перемешайте. Разделение фаз должно стать заметным.

Добавьте 2,0 миллилитра дистиллированной воды в каждый образец, чтобы разорвать фазу. После вортексирования образцов в течение 30 секунд центрифугируйте образцы при 226-кратном G в течение двух минут. С помощью короткой пастеровской пипетки переложите верхнюю фазу в чистые, промаркированные, 10-миллилитровые флаконы.

Будьте осторожны, чтобы не перенести нижнюю водную фазу. Добавьте 2,0 миллилитров гексана в каждую пробирку центрифуги для образца и перемешайте. Наведите образцы на вихрь в течение 30 секунд, а затем центрифугируйте, как и раньше.

С помощью короткой пастеровской пипетки снова добавьте верхнюю фазу в помеченные 10-миллилитровые стеклянные флаконы. Выпарить растворитель в маркированных стеклянных флаконах объемом 10 миллилитров при комнатной температуре под воздействием азота. Закрутите крышки с подкладкой из ПТФЭ и оберните образцы алюминиевой фольгой.

Храните образцы в морозильной камере при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока не будете готовы приступить к анализу газовой хроматографии, как описано в текстовом протоколе. Здесь показана репрезентативная хроматограмма, полученная в результате подвергнутия образца капиллярной газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора. Время хранения в минутах указано для PLFA в скобках.

Ответы от всех PLFA могут быть суммированы для получения общей биомассы PLFA в наномолях на грамм почвы. Также можно рассчитать и сравнить относительное распределение различных групп PLFA между почвами. Результаты указывают на большее общее количество PLFAs для почвы на первом участке, который расположен под более старыми деревьями, за которым следует почва под деревьями среднего возраста на втором участке.

И, наконец, почва под самыми молодыми деревьями, на участке три. Относительно более насыщенные PLFAs присутствуют на самом молодом участке, в то время как более ненасыщенные PLFAs присутствуют на самом старом участке. Результаты PLFA могут быть дополнительно проанализированы с использованием методов многомерной ординации, таких как неметрическая, многомерная шкалированная ординация, как показано здесь.

Самый молодой участок очень четко отделяется от двух более старых участков, которые демонстрируют перекрытие в составе микробного сообщества PLFA. В скобках указана степень вариации в данных сообщества PLFA, объясняемая каждой осью. Как только эта техника будет освоена, один человек может обработать 20 образцов в течение четырех дней.

При использовании этого протокола важно помнить, что липиды особенно чувствительны к окислению. Следовательно, важно защищать образцы от воздействия воздуха и света, например, храня их в темноте и под воздействием азота. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как количественно оценить структуру почвенных микробных сообществ путем идентификации фосфолипидных жирных кислот с помощью трехступенчатого процесса: экстракции липидов, фракционирования липидов и метилирования липидов.