Слоистые альгината конструкты: Платформа для совместного культивирования разнотипных клеточных популяций

Общая цель данной процедуры заключается в воспроизводимом создании двухслойных дисков из альгинатного гидрогеля для исследования взаимосвязей между различными популяциями клеток в условиях 3D-сокультивирования. Этот метод облегчает изучение взаимодействий между несколькими популяциями клеток в пространственно неоднородных 3D-культурах, что может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области тканевой инженерии и физиологии нагружаемых тканей. Основным преимуществом данной методики является то, что она предлагает простой, экономичный и воспроизводимый способ создания многослойных альгинатных гидрогелей с заселенными клетками, структура которых благоприятна для механической стимуляции.

Эту процедуру продемонстрирует Пунам Шарма, аспирантка моей лаборатории. Чтобы сформировать альгинатные диски, сначала положите кусочек плотной фильтровальной бумаги на концевую пластину размером три на три дюйма, а затем на нее — мембрану микросита для клеток. С помощью стерильного шпателя разгладьте мембрану и фильтровальную бумагу.

Затем переверните стопку на слой бумажных полотенец и сожмите материалы, чтобы удалить излишки раствора хлорида кальция. Далее поместите форму для создания геля с цилиндрическими лунками поверх микроситовой мембраны и с помощью зажимов-биндеров аккуратно закрепите форму к торцевой пластине с левой и правой сторон. Теперь положите лист толстой фильтровальной бумаги на маленькую торцевую пластину, затем сверху положите фрагмент микроситовой мембраны и переверните стопку, чтобы удалить излишки хлорида кальция, как было продемонстрировано ранее.

Когда обе половины формы будут готовы, ресуспендируйте 1 × 10⁶ интересующих клеток на миллилитр стерильной альгинатной среды. При правильном распределении клеток смесь будет выглядеть однородно мутной. Затем по каплям перенесите 130 µL клеточной суспензии в отдельные лунки диаметром 6 мм и высотой 3 мм в нижней половине конструкции формы.

Над краем каждой лунки должен быть виден небольшой выпуклый мениск. После посева всех клеток с помощью стерильного шпателя осторожно разгладьте верхнюю половину конструкции формы. Затем переверните форму так, чтобы микроситовая мембрана оказалась сверху, и поместите форму на лунки, стараясь полностью закрыть лунки, содержащие смеси клеток и альгината.

После установки формы поднимите конструкцию с загруженной формой и, плотно нажав на центр, закрепите оставшиеся две стороны конструкции биндерными зажимами, чтобы соединить верхнюю и нижнюю половины формы. Растворы альгината с клетками должны быть надежно расположены в лунках. Затем полностью погрузите конструкцию формы в ванночку с 102 millimolar хлоридом кальция в ламинарном шкафу для культивирования клеток при комнатной температуре на 90 минут.

По окончании инкубации перенесите конструкцию на стопку бумажных полотенец и снимите два зажима, фиксирующих верхнюю торцевую пластину с формы. Разделите две половины конструкции. В сформированных в лунках гидрогелях не должно быть пузырьков воздуха, и они должны полностью заполнять лунки.

Снимите два оставшихся зажима и отделите форму с гидрогелем от оставшейся концевой пластины. С помощью шпателя аккуратно проведите вдоль края лунок с гидрогелями, чтобы осторожно высвободить гели. Затем перенесите гидрогели непосредственно в ванночку с DPBS, содержащим хлорид кальция и хлорид магния.

Через одну-пять минут перенесите гидрогели в отдельные лунки планшета на шесть лунок, содержащего достаточное количество питательной среды для базилика, чтобы полностью погрузить гели минимум на один час при 37 °C и 5% CO2. В течение последних 30 минут инкубации с помощью зажимов-биндеров закрепите форму с лунками, высота которых составляет половину высоты формы для создания геля, к алюминиевым торцевым пластинам размером 3x3 дюйма или 3x1,5 дюйма с левой и правой сторон, чтобы создать режущую форму. Затем создайте форму для отжига, закрепив зажимами форму с лунками, диаметр которых на 3 мм больше, чем в форме для создания геля, к алюминиевым торцевым пластинам размером 3x3 дюйма с левой и правой сторон.

Теперь перенесите гидрогели в лунки формы для резки. Каждый гель должен плотно прилегать к лунке, при этом половина геля должна выступать над формой. С помощью скальпеля сделайте разрез вдоль поверхности формы, чтобы разрезать гидрогель пополам.

Переверните верхнюю половину геля и поместите её в открытую лунку формы. Фрагмент геля должен плотно прилегать к стенкам лунки; при этом обе половины должны быть по высоте равны форме, а их разрезанные внутренние поверхности должны быть видны. Затем накройте лунки фрагментом сухой микроситовой мембраны для клеток, убедившись, что мембрана соприкасается со всеми половинами геля, которые необходимо соединить, и накройте мембрану куском плотной фильтровальной бумаги.

Когда гели будут полностью покрыты, пропитайте фильтровальную бумагу раствором цитрата натрия с добавлением EDTA и инкубируйте гели при комнатной температуре. Через одну минуту удалите мембрану микросита для клеток и плотную фильтровальную бумагу, а затем снимите зажимы. После этого откройте форму и перенесите половину геля в подготовленную форму для отжига срезом вверх.

С помощью шпателя перенесите вторую обработанную половину геля на первый гель так, чтобы срезанная поверхность соприкасалась со срезанной поверхностью первого геля. После размещения всех гелей аккуратно прижмите их шпателем, чтобы удалить пузырьки воздуха, и осторожно погрузите форму для отжига в ванночку с хлоридом кальция. Через 30 минут перенесите форму для отжига на стопку бумажных полотенец и снимите зажимы.

Затем отделите форму от торцевой пластины и на короткое время перенесите гели в ванночку с DPBS, после чего погрузите их в соответствующую среду для культивирования клеток. Готовые двухслойные гели демонстрируют полное исходное разделение клеточных популяций, что видно на данном изображении клеток 293 FT, помеченных зеленым или красным красителем cell tracker. Жизнеспособность мезенхимальных стволовых клеток человека, встроенных после отжига, в многослойных гидрогелях остается высокой, что сопоставимо с жизнеспособностью клеток в объемных гидрогелях.

После выделения пикового напряжения для каждого цикла в ходе четырехчасового циклического сжатия без ограничений, бесклеточные слоистые гидрогели демонстрируют стрессовый ответ на циклическое сжатие, величина которого значительно меньше по сравнению с объемными неслоистыми бесклеточными гидрогелями, несмотря на то, что оба типа гидрогеля остаются целостными после семи дней культивирования. При должном освоении эта методика, включая подготовку всех материалов, может быть выполнена менее чем за четыре с половиной часа при правильном подходе. При выполнении данной процедуры важно действовать обдуманно и медленно, чтобы предотвратить ошибки и легче отслеживать различные образцы.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как механическая стимуляция и иммуноокрашивание, чтобы ответить на дополнительные вопросы о взаимодействии различных популяций клеток в формирующихся внеклеточных матриксах. Эта методика позволит исследователям в области механобиологии и тканевой инженерии более легко изучать взаимосвязи между различными популяциями клеток, такими как мезенхимальные стволовые клетки, хондроциты и клетки пульпозного ядра. Помните, что работа с острыми предметами, биологическими материалами и особенно с клетками человека может быть крайне опасна, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих средств индивидуальной защиты.